徐瑞鳳, 石 敏, 尤長宣, 呂成偉, 羅榮城, 廖旺軍

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院腫瘤中心, 廣東 廣州 510515)

目前,以放化療相結合的綜合治療是鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)的有效治療手段,但仍有約40%-50%患者出現(xiàn)局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移。對于治療失敗的患者,尋找新的治療方法顯得尤為重要。研究表明NPC患者的樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)數(shù)目有限,免疫功能低下,無法有效地處理和遞呈腫瘤抗原可能是腫瘤逃避機體免疫監(jiān)視的主要原因[1]。以DC疫苗為代表的細胞免疫治療給常規(guī)放化療治療失敗的NPC患者帶來了希望。然而如何安全、高效的將目的基因轉(zhuǎn)染DC是制備DC疫苗的瓶頸之一。本實驗探討超聲及微泡造影劑介導基因轉(zhuǎn)染DC的有效性,并進一步觀察LMP-1為靶點的DC疫苗對LMP-1陽性NPC細胞株C666-1的體外殺傷作用。

1 材料與方法

1 材料與儀器:重組人白細胞介素2(IL-2)、重組人白細胞介素4(IL-4)、重組人白細胞介素7(IL-7)、重組人粒細胞-巨噬細胞克隆刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)購自Sigma公司;AIM-V培養(yǎng)基購自GIBCO公司;淋巴細胞分離液購自天津血液研究所;質(zhì)粒提取試劑盒購自Invitrogen公司;超聲微泡造影劑聲諾維(Sono Vue)為意大利Bracco公司產(chǎn)品。熒光標記鼠抗人單克隆抗體CD80、CD83、CD86、CD40、H LA-DR為美國BD公司產(chǎn)品。綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒pEGFP-C3-LMP-1、NPC細胞株C666-1、Ecoli DH5α菌株由本室保存。儀器:超聲診斷儀為Sequoia 512彩色多普勒診斷儀購自Siemens公司;流式細胞儀FACSCalibur為美國BD公司產(chǎn)品;熒光顯微鏡IX71購自Olympus公司。

1.2 方 法

1.2.1 外周血DC和淋巴細胞(PBL)的分離與培養(yǎng):無菌抽取人外周血,外周血來自與C666-1細胞HLA配型相近的健康志愿者,采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞,培養(yǎng)于6孔板中。貼壁5h后輕輕洗去懸浮細胞,貼壁細胞即為DC的前體細胞,加入含GM-CSF(終濃度為800 U/mL)、IL-4(終濃度為1000 U/mL)的AIM-V 培養(yǎng)基,隔天半換液。第5、6天加入TNF-α(終濃度為100 U/ml),第7天獲得懸浮細胞。上述洗去的懸浮細胞即為PBL,培養(yǎng)于含IL-2(終濃度為20U/mL)的AIM-V培養(yǎng)基中,隔天半量換液。

1.2.2 質(zhì)粒/微泡造影劑混合物的制備及質(zhì)粒pEGFP-C3-LMP1轉(zhuǎn)染DC:使用前向每支微泡造影劑SonoVue中加入5mL生理鹽水,輕輕振蕩混勻,置4℃冰箱靜置30 min。6孔板加入微泡-質(zhì)?；旌弦?其中每孔加入10ul質(zhì)粒pEGFP-C3-LMP1(1ug/uL)。實驗分為4組:①單純質(zhì)粒組(A組):加入質(zhì)粒;②超聲照射組(B組):質(zhì)粒+超聲輻照;③微泡造影劑組(C組):質(zhì)粒+微泡造影劑;④超聲+微泡造影劑組(D組):質(zhì)粒+微泡造影劑+超聲輻照。輻照時探頭放置于培養(yǎng)板下方,加少量耦合劑,使探頭緊貼培養(yǎng)板底部照射。本實驗的超聲照射條件統(tǒng)一設為頻率1.5MHz,機械指數(shù)1.0,為照射時間1min,微泡造影劑濃度為20%。另將體外培養(yǎng)的DC分為兩組用于檢測DC表面表型的表達及體外殺傷實驗:①空白對照組,單純培養(yǎng)的DC;②基因轉(zhuǎn)染組,具體實驗方法同上述D組。

1.2.3 流式細胞儀評價GFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率及檢測DC表面分子表型的表達。

1.2.3.1 流式細胞儀評價GFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率:上述各種實驗條件處理后的細胞,立即置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后更換為新鮮的AIM-V培養(yǎng)基,分別于12h、24h、48h在熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)GFP表達情況并攝片。48h后收集細胞,流式細胞儀檢測各組細胞GFP的表達情況,每組測10000個細胞,GFP陽性細胞的陽性率即為轉(zhuǎn)染率。

1.2.3.2 流式細胞儀檢測DC表面分子表型的表達:分別取基因轉(zhuǎn)染組及空白對照組的DC,用流式細胞儀檢測其表面表型 CD80 、CD83 、CD86 、CD40 、H LADR的表達情況。

1.2.4 混合淋巴細胞反應(MLR):上述基因轉(zhuǎn)染組及空白對照組培養(yǎng)第7天的DC與PBL按1:20的比例混合,培養(yǎng)于含GM-CSF(終濃度為800 U/mL)、IL-2(終濃度為20 U/mL)、IL-7(終濃度為 20ng/mL)的AIM-V培養(yǎng)基,隔天半量換液,共培養(yǎng)7天,獲得CTL。

1.2.5 MTT法測CTL對LMP1陽性的NPC細胞株C666-1的體外殺傷作用:NPC細胞株C666-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。取對數(shù)生長期的C666-1細胞作為靶細胞,另將體外培養(yǎng)的DC分為兩組:①空白對照組,單純培養(yǎng)的DC;②基因轉(zhuǎn)染組,具體實驗方法同上述D組。將效應細胞與靶細胞按10:1的比例接種于96孔板中,終體積為200 uL。同時設單獨效應細胞和靶細胞對照。效應細胞與靶細胞共培養(yǎng)24h后,每孔加入10 uL M TT(終濃度為5mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4h后收集細胞,1000r/min離心 10 min,棄上清,加入 150uL DMSO,低速振蕩10 min,待藍色結晶物充分溶解后,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處檢測各孔的吸光值A。CT L殺傷效率=[1-(效靶A值-效應細胞A值)/靶細胞A值]×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析:采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以±s表示。組間比較采用完全隨機設計資料的方差分析,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 熒光顯微鏡下觀察GFP在DC內(nèi)表達:超聲輻照12h后,細胞內(nèi)開始有GFP表達,熒光強度以48h最亮,以后逐漸減弱,不同組別DC內(nèi)GFP的表達不同。

圖1 A-D分別為A,B,C,D組DC內(nèi)GFP的表達情況(×250)

2.2 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率,見表1。

表1 各組別基因轉(zhuǎn)染效率的比較(%,±s)

表1 各組別基因轉(zhuǎn)染效率的比較(%,±s)

注:D組和其余3組間均有顯著性差異(P＜0.01),A、B、C組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

實驗分組 轉(zhuǎn)染效率A組 2.13±0.43 B組 3.90±0.81 C組 2.41±0.53 D組 14.86±2.36

圖2 A基因轉(zhuǎn)染組DC表面標志的表達

圖2 B空白對照組DC表面標志的表達

2.3 流式細胞儀分析DC表面免疫表型的表達:FACS結果顯示,基因轉(zhuǎn)染組成熟DC表面的分子標志 HLA-DR、CD40、CD80、CD83、CD86 的比例分別為 84.70%、49.42%、65.63%、76.78%、82.01%,均高于對照組DC的 61.35%、26.85%、28.05%、32.93%、64.12%(見圖2)。

2.4 致敏DC誘導的CT L對NPC細胞的殺傷作用:基因轉(zhuǎn)染組的DC所誘導的CT L對表達LMP-1的C666-1細胞有明顯的殺傷作用,其殺傷效率為(41.72±3.53)%,而空白對照組殺傷效率為(7.62±2.36)%,兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

3 討 論

制備DC疫苗的關鍵步驟是如何將基因?qū)爰毎?目前常用的基因載體有病毒載體和非病毒載體。病毒載體轉(zhuǎn)染效率較高,轉(zhuǎn)染后基因表達相對穩(wěn)定,但病毒自身的免疫原性和潛在的致瘤致畸作用限制了其臨床應用。非病毒載體轉(zhuǎn)染方法如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、超聲穿孔等轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定,但其因安全性較高、耐受性較好、操作簡便、可使基因靶向轉(zhuǎn)染、藥物靶向釋放而越來越受到青睞。

微泡造影劑的主要成分微泡是由氣體構成的核心和糖類、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或多聚化合物構成的外殼組成。在超聲照射下,微泡造影劑破裂所產(chǎn)生的空化效應引起細胞膜通透性增加,促使質(zhì)粒DNA進入細胞內(nèi),從而顯著的提高基因的轉(zhuǎn)染率[2,3]。微泡造影劑最早被用于心臟血管的顯影,隨著微泡造影劑及超聲造影技術的發(fā)展,目前已廣泛應用于肝臟、腎臟、胃腸等器官的顯影。近年來開始在基因轉(zhuǎn)染及攜帶藥物靶向性治療腫瘤方面進行微泡造影劑的研究。

據(jù)報道,超聲聯(lián)合微泡造影劑在肝癌細胞、血管內(nèi)皮細胞、宮頸癌細胞、胰腺癌細胞等多個體外培養(yǎng)的細胞株中成功地促進了基因轉(zhuǎn)染[4,5]。然而超聲聯(lián)合微泡造影劑促進基因轉(zhuǎn)染DC的研究甚少。本研究探討了超聲聯(lián)合微泡造影劑介導基因轉(zhuǎn)染DC的有效性及與傳統(tǒng)非病毒轉(zhuǎn)染方法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的比較。結果顯示裸質(zhì)粒組、單獨微泡造影劑組、超聲輻照組基因轉(zhuǎn)染效率較低。當超聲聯(lián)合微泡造影劑時,轉(zhuǎn)染效率則大大提高,和國內(nèi)外報道相符。Lawrie A等[6]的研究顯示,和裸質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比,超聲輻照可使基因轉(zhuǎn)染效率提高10倍,如聯(lián)合微泡造影劑,則基因轉(zhuǎn)染效率提高3000倍。和既往的研究相比,超聲聯(lián)合微泡造影劑介導的基因轉(zhuǎn)染效率遠遠低于病毒載體,略低于脂質(zhì)體。但微泡造影劑轉(zhuǎn)染法有前兩者無可比擬的優(yōu)勢,即經(jīng)體表對特定的器官和組織輔以一定的能量照射,微泡造影劑所攜帶的基因或藥物可在體內(nèi)局部釋放,從而達到靶向性目的,可能會取得更高的殺瘤活性。

成熟DC能有效激活初始型T細胞,處于啟動、調(diào)控并維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)。成熟DC的鑒定,除了其典型的形態(tài)學外,還需綜合其表面標志CD80、CD83、CD86、CD40 、H LA-DR 等的表達情況。其中共刺激分子CD40、CD80、CD86是成熟DC發(fā)揮功能的主要標志。超聲微泡造影劑聯(lián)合脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染組 DC表面標志的表達高于空白對照組,其中CD80、CD83、CD86的表達與Ying Pan等[7]的報道基本一致。研究結果說明基因轉(zhuǎn)染DC后并無影響DC的成熟和DC的功能。

EB病毒(EBV)與NPC的發(fā)生密切相關,LMP-1目前被廣泛認為是EBV的致瘤基因,在NPC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用[8]。然而LMP-1作為NPC生物治療靶點的研究較少。Gottschalk S等[9]的研究表明LMP-1轉(zhuǎn)染后的DC可以使鼻咽癌患者外周血中LMP-1特異性的CT L增高500-3800倍,而針對LMP-1為靶點的后續(xù)的體外殺傷實驗未見相應報道。本研究選取LMP-1作為轉(zhuǎn)染基因,結果顯示LMP-1轉(zhuǎn)染組DC所誘導的CTL對表達LMP-1的C666-1細胞殺傷效率,明顯高于對照組。這一研究結果表明,DC在GM-CSF、IL-4、TNF-α的刺激下及腫瘤抗原的修飾下,發(fā)揮了良好的抗原遞呈作用,有效地激活CTL發(fā)揮殺傷作用。而空白對照組因沒有腫瘤相關抗原遞呈,從而無法誘導T細胞產(chǎn)生特異性的免疫反應,因而對靶細胞的殺傷效率較低。

綜上所述,本研究結果表明超聲聯(lián)合微泡造影劑可增強基因轉(zhuǎn)染DC,以DC/CT L為基礎的細胞免疫是一種有效的抗腫瘤方法。目前該轉(zhuǎn)染方法基因轉(zhuǎn)染效率尚不穩(wěn)定,對于不同的細胞株、不同的基因轉(zhuǎn)染效率相差較大,且超聲作用的最佳參數(shù)也不盡相同。超聲微泡造影劑用于基因轉(zhuǎn)染尚處于起步階段,但具有其它基因方法所不具備的優(yōu)勢。相信隨著超聲作用參數(shù)的進一步優(yōu)化和造影技術的深入研究,超聲聯(lián)合微泡造影劑在腫瘤治療中將會有廣闊的應用前景。

[1]Gabrilovich DI,Ciernik IF,Carbone DP.Dendritic cells in antitumor immune responses.I.Defective antigen presentation in tumor-bearing hosts[J].Cell Immunol,1996,170(1):101-110.

[2]Sundaram J,Mellein BR,Mitragotri S.An experimental and theoretical analysis of ultrasound induced permeabilization of cell membranes[J].Biophys,2003,84(5):3087-3101.

[3]Juffermans LJ,Meijering DB,Van Wamel A,et al.Ultrasound and microbubble-targeted delivery of therapeutic compounds:ICIN Report Project 49:Drug and gene delivery through ultrasound and microbubbles[J].Neth Heart,2009,17(2):82-86.

[4]Lawrie A,Brisken AF,Francis SE.Ultrasound enhances reporter gene expression after transfection of vascular cells in vitro[J].Circulation,1999,99(20):2617-2620.

[5]Guo DP,Li XY,Sun P,et al.Ultrasound-targeted microbubble destruction improves the low density lipoprotein receptor gene expression in HepG2 cells[J].Biochem Biophys Res Commn,2001,343(2):470-474.

[6]Lawrie A,Brisken AF,Francis SE,et a1.Microbubble enchanced ultrasound for vascular delivery[J].Gene Ther.2000,7(23):2023-2027.

[7]Pan Y,Zhang J,Zhou L,et al.In vitro anti-tumor immune response induced by dendritic cells transfected with EBV-LM P2 recombinant adenovirus[J].Biochem Biophys Res Commn,2006,347(3):551-557.

[8]Zheng H,Li LL,Hu DS,et al.Role of Epstein-Barr virus encoded latent membrane protein 1 in the carcinogenesis of nasopharyngeal carcinoma[J].Cell Mol Immunol,2007,4(3):185-196.

[9]Gottschalk S,Edwards OL,Sili U.Generating CT Ls against the subdominant Epstein-Barrvirus LMP1 antigen for the adoptive immunotherapy of EBV-associated malignancies[J].Blood,2003,101(5):1905-1912.