王偉章 金小寶 毛建文 鄭敏

廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生物教研室，*寄生蟲學(xué)教研室，廣東 廣州510006

細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1和2 (checkpoint kkii--nase，Chkl和Chk2)，是細(xì)胞周期檢測中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白激酶，在藥物、電離輻射(IR)和紫外線(NV)等引起的S期和G2/M期檢測點(diǎn)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，有可能成為腫瘤放化療增敏的新靶點(diǎn)［1］。姜黃素是從植物姜黃中提取出來的天然產(chǎn)物，細(xì)胞和動物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃素具有抗腫瘤及預(yù)防癌變的藥理作用，有望成為新的抗腫瘤藥物［2］。然而，以 Chk1/2作為姜黃素治療腫瘤增敏靶點(diǎn)的研究卻很少有報道。我們已報道姜黃素能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Huh7發(fā)生凋亡［3］，本研究通過檢測Chkl/2 siRNA對姜黃素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞Huh7凋亡影響，以探討Chkl/2作為姜黃素治療肝癌增敏靶點(diǎn)的有效性。

1 材料和方法

1.1 材料 姜黃素，碘化丙啶（pprroopp--idium iodide，PI）和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）購自美國Sigma公司。RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司。TRIzol和Oligofectamine試劑購自美國Invitrogen公司。Chk1、Chk2、p-Chk2（T68）、p-Chk1（S317）、p-Cdc25C（S216）和p-Cdk1（Y15）多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)山羊抗兔和羊抗小鼠IgG均購自丹麥DAKO公司。ECL購自美國Pierce公司。BCA蛋白定量試劑盒購自申能博彩生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Huh7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清（澳大利亞的PAA公司）的DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）中，置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的37 ℃培養(yǎng)箱。

1.2.2 Chk1/2 siRNA轉(zhuǎn)染 Chk1/2及對照siRNA由廣州銳博生物科技有限公司合成。Chk1序列：5’-AAGAAGCAGTCGCAGTTGGAAAA--GATTGTAG-3’；Chk2序列：5’-AAGAACCTGAGGACCAAGAACCTGAGG-3’；對照序列：5’-CGUACUGUCGACACUGAAACGGACA-3’。采用Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作如下：轉(zhuǎn)染前1天用胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000×g離心5 min后重懸于含有10%FBS的DMEM中，按3×104/孔的密度接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 h將細(xì)胞的培養(yǎng)上清液換成200 μL opti-MEM。將0.625 μL siRNA（終濃度50 nmol/L）稀釋于40 μL opti-MEM中，輕敲管壁混勻；另外，將1 μL 的Oligofectamine稀釋于7.5 μL opti-MEM中，室溫放置5 min；5 min后將兩種稀釋液混合，輕敲管壁混勻，室溫放置15 min。15 min后將Oligofectamine/siRNA混合液加入培養(yǎng)孔中，混勻后培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；3 h 后加入含有30%FBS的DMEM，使血清終濃度為10%，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.3 RT-PCR檢測 Chk1/2 siRNA按1.2.2方法轉(zhuǎn)染后分別提取總RNA和總蛋白?？俁NA以TRIzol試劑進(jìn)行提取，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察RNA完整性，紫外分光光度計測定RNA的含量。RT使用Promega公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以特異引物進(jìn)行PCR，檢測目標(biāo)基因mRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，28個循環(huán)后于72 ℃再延伸8 min。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)分析成像，用Bankscan軟件進(jìn)行灰度分析，Chk1和Chk2基因的表達(dá)水平分別用hPBGD和β-actin為內(nèi)源對照。所用引物序列應(yīng)用Primer premier 5.0軟件自行設(shè)計，由上海英駿公司合成。引物序列為：Chk1 F：5’-CCTTTGTGGAAGACTGGGACT-3’，R：5’-GAGGTTATCCCTTTCATCCAAC-3’，產(chǎn)物長度422 bp;Chk2 F：5’-TCGTGATGTCTCGGGAGTCG-3’，R：5’-GAGTTTGGCATCGTGCTGGT-3’，產(chǎn)物長度151 bp；hPBGD F：5’-TCTGGTAACGGCAATGCGG-3’，R：5’-GCAGATGGCTCCGATGGTG-3’，產(chǎn)物長度271 bp；β-actin F：5’-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3’，R：5’-CCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，產(chǎn)物長度295 bp?？偟鞍装?.2.4方法進(jìn)行檢測。

1.2.4 Western blot檢測 終濃度為25μmol/L的姜黃素處理Huh7細(xì)胞2、12、24、和36 h后，收集細(xì)胞并提取蛋白，通過BCA試劑盒測定各組的蛋白濃度。0.1%DMSO處理的樣品作為溶劑對照組。樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，濕電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，膜在室溫下用封閉液封閉2 h，加入1%BSA稀釋的p-Chk2（T68）、p-Chk1（S317）、p-Cdc25C（S216）、p-Cdk1（Y15）和β-actin抗體（1∶1000），4 ℃過夜，洗膜后加入封閉液稀釋的二抗稀釋液（1∶5000），室溫2 h。用ECL solution 顯色，最后進(jìn)行顯影、定影。用Bankscan軟件進(jìn)行灰度分析，分析目標(biāo)基因的表達(dá)水平時用β-actin為內(nèi)源對照。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對細(xì)胞周期檢測點(diǎn)信號通路蛋白的影響 為了觀察Chk1和Chk2在此過程中的作用，我們首先檢測了姜黃素處理Huh7細(xì)胞后對Chk2（T68）、Chk1（S317）、Cdc25C（S216）和Cdk1（Y15）蛋白磷酸化的影響。Western blot結(jié)果顯示（圖1），與對照組相比，Chk1（S317）、Cdc25C（S216）和Cdk1（Y15）的磷酸化水平隨著姜黃素處理時間的延長而逐漸明顯減少（P＜0.01），Chk2的磷酸化水平無明顯變化。

2.2 Chk1/2 siRNA對Chk1/2表達(dá)的影響 為檢測Chk1/2 siRNA是否可以有效降低Huh7細(xì)胞中Chk1/2的表達(dá)，我們對其mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平分別進(jìn)行了分析。RT-PCR 和Western blot結(jié)果顯示，針對Chk1/2的siRNA可以顯著降低Huh7細(xì)胞中Chk1/2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平（P＜0.01，圖2A和B）。結(jié)果表明，針對Chk1/2的siRNA可以有效沉默Huh7細(xì)胞中Chk1/2的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

2.3 Chk1/2 siRNA對姜黃素誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Chk1 siRNA 48 h后給予25 μmol/L姜黃素刺激24 h，Huh7細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)明顯高于轉(zhuǎn)染NC siRNA組（P＜0.05），表明抑制Chk1表達(dá)可顯著增強(qiáng)姜黃素誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡（圖3）。而抑制Chk2后Huh7的細(xì)胞凋亡率并無明顯變化，表明抑制Chk2表達(dá)并不能促進(jìn)姜黃素誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡。

2.4 Chk1/2 siRNA對姜黃素處理后Huh7細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC siRNA相比，轉(zhuǎn)染Chk1/2 siRNA 48 h后給予25 μmol/L姜黃素刺激24 h，Huh7細(xì)胞周期并無明顯變化，表明抑制Chk1/2表達(dá)對姜黃素處理后Huh7細(xì)胞周期并無顯著的影響（圖4）。

3 討 論

圖1 姜黃素抑制Chk1（S317）、Cdc25C（S216）和Cdk1（Y15）蛋白的磷酸化Fig.1 Curcumin inhibited phorsphorylations of Chk1(S317), Cdc25C(S216) and Cdk1(Y15) proteins

圖2 Chk1/2 siRNA對Chk1/2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of Chk1 (A) and Chk2 (B) siRNA on the expressions of Chk1/2 in both mRNA and proteins

圖3 Chk1/2 siRNA對姜黃素誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Chk1/2 siRNA on curcumin-induced apoptosis in Huh7 cells (magnification, ×200)

圖4 Chk1/2 siRNA對姜黃素處理后Huh7細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of Chk1/2 siRNA on cell cycle distribution in curcumin-treated Huh7 cells

耐藥性是嚴(yán)重影響抗腫瘤藥物療效和導(dǎo)致腫瘤治療失敗的主要原因之一。腫瘤耐藥與腫瘤細(xì)胞逃避放化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而腫瘤細(xì)胞逃避凋亡的機(jī)制與細(xì)胞周期檢測點(diǎn)有關(guān)。細(xì)胞周期檢測點(diǎn)在放化療作用下被激活，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞的損傷修復(fù)，從而使細(xì)胞避免凋亡。因此，滅活腫瘤細(xì)胞周期檢測點(diǎn)，增強(qiáng)腫瘤治療敏感性，已成為創(chuàng)新藥物研究的熱點(diǎn)之一。以往多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，通過不同方法抑制Chk1活性都是通過消除G2/M期阻滯來增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性［4-6］。然而，有研究報道，Chk1的抑制劑可以通過不依賴于消除G2/M期阻滯的方式增強(qiáng)紫杉醇對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用［7］。本研究也發(fā)現(xiàn)，盡管抑制Chk1后姜黃素對Huh7細(xì)胞的細(xì)胞周期并無明顯影響，抑制Chk1同樣能夠增強(qiáng)姜黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Huh7凋亡。由此可見，Chk1可以作為腫瘤放化療增敏的有效靶點(diǎn)。

Chkl是一種進(jìn)化上高度保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶。當(dāng)DNA損傷或復(fù)制阻滯后，通過ATR磷酸化Chk1第317位絲氨酸（S317）和第345位絲氨酸（S345）而使Chk1激活，活化的Chk1可磷酸化Cdc25C的Ser216位點(diǎn)，該位點(diǎn)的磷酸化導(dǎo)致14-3-3δ與Cdc25C發(fā)生抑制性結(jié)合和Cdc25C的核輸出，這樣Cdc25C就無法去磷酸化Cdk1的Tyr15位點(diǎn)，從而不能活化cyclinB/Cdk1復(fù)合物，引起G2/M期周期阻滯［8-10］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠明顯抑制Chk1（S317），Cdc25C（S216）和Cdk1（Y15）蛋白的磷酸化水平，提示姜黃素可能通過抑制Chk1介導(dǎo)的G2/M期檢測點(diǎn)的激活來誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡。因此，我們設(shè)想通過RNAi技術(shù)沉默Chk1蛋白的表達(dá)可能進(jìn)一步促進(jìn)姜黃素誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡。與我們設(shè)想一致的是，抑制Chk1的確能夠顯著增加姜黃素誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞的凋亡率。但是沉默Chk2并無此作用，這可能與姜黃素處理Huh7細(xì)胞后并不影響Chk2的磷酸化水平相關(guān)。然而，最近的研究［11］發(fā)現(xiàn)姜黃素誘導(dǎo)前列腺癌BxPC-3細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡，通過RNAi（RNA干擾）的方法抑制Chk1表達(dá)能夠明顯抑制姜黃素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明Chk1是姜黃素誘導(dǎo)BxPC-3細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白。這些相反的研究結(jié)果可能與Chk1在不同組織中發(fā)揮的作用不同所致，有待進(jìn)一步的研究。

我們以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抑制Chk1介導(dǎo)的G2/M期阻滯可以增強(qiáng)姜黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Hep3B凋亡［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制Chk1也可以通過非細(xì)胞周期阻滯消除的方式提高姜黃素對肝癌細(xì)胞Huh7的作用效果。因此，Chk1可以作為肝癌治療增敏的有效靶點(diǎn)，Chk1 siRNA與姜黃素聯(lián)合治療有望成為治療肝癌的新途徑。

［1］ Bartek J, Lukas J. Chk1 and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer［J］. Cancer Cell, 2003, 3(5): 421-429.

［2］ Hatcher H, Planalp R, Cho J, et al. Curcumin: from ancient medicine to current clinical trials［J］. Cell Mol Life Sci,2008, 65(11): 1631-1652.

［3］ Wang WZ, Cheng J, Luo J, et al. Abrogation of G2/M arrest sensitizes curcumin-resistant hepatoma cells to apoptosis［J］. FEBS Lett, 2008, 582(18): 2689-2695.

［4］ Hirose Y, Berger MS, Pieper RO. Abrogation of the Chk1-mediated G(2) checkpoint pathway potentiates temozolomideinduced toxicity in a p53-independent manner in human glioblastoma cells［J］. Cancer Res, 2001, 61(15): 5843-5849.

［5］ Huang M, Miao ZH, Zhu H, et al. Chk1 and Chk2 are differentially involved in homologous recombination repair and cell cycle arrest in response to DNA double-strand breaks induced by camptothecins［J］. Mol Cancer Ther, 2008, 7(6):1440-1449.

［6］ Syljuasen RG, Sorensen CS, Nylandsted J, et al. Inhibition of Chk1 by CEP-3891 accelerates mitotic nuclear fragmentation in response to ionizing radiation［J］. Cancer Res, 2004,64(24): 9035-9040.

［7］ Xiao Z, Xue J, Semizarov D, et al. Novel indication for cancer therapy: Chk1 inhibition sensitizes tumor cells to antimitotics［J］. Int J Cancer, 2005, 115(4): 528-538.

［8］ Furnari B, Rhind N, Russell P. Cdc25 mitotic inducer targeted by chk1 DNA damage checkpoint kinase［J］. Science, 1997,277(5331): 1495-1497.

［9］ Peng CY, Graves PR, Thoma RS, et al. Mitotic and G2checkpoint control: regulation of 14-3-3 protein binding by phosphorylation of Cdc25C on serine-216［J］. Science,1997, 277(5331): 1501-1505.

［10］ Sanchez Y, Wong C, Thoma RS, et al. Conservation of the Chk1 checkpoint pathway in mammals: linkage of DNA damage to Cdk regulation through Cdc25［J］. Science,1997, 277(5331): 1497-1501.

［11］ Sahu RP, Batra S, Srivastava SK. Activation of ATM/Chk1 by curcumin causes cell cycle arrest and apoptosis in human pancreatic cancer cells［J］. Br J Cancer, 2009, 100(9):1425-1433.