崔曉楠 梁鑫淼 侯力

1.大連醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116011；2.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023；3.大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學教研室，遼寧 大連 116023

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一［1］，雖然其診斷和治療近年得到很大的發(fā)展，但社會依然期待著更加安全有效的治療藥物的不斷開發(fā)［2］。血管新生與腫瘤的生長和轉移密切相關［3］，抑制新生血管的形成已經(jīng)成為腫瘤治療的重要戰(zhàn)略［4］。血管新生是一個多步驟的過程，其完成依賴于內(nèi)皮細胞的生長及其與周圍基質的相互作用。煙曲霉素（Fumagillin）是一種從真菌中提取的藥物，它能特異性地抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖［5］?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FFuu--magillin的作用靶標為甲硫氨酸氨基肽酶2（type 2 methionine aminopeptidase，MetAP2）［6］，但其抑制內(nèi)皮細胞增殖的機制尚未闡明。Cyclo（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val）是含 Arg-Gly-Asp（RGD）序列的寡肽［7］，可通過與整合素結合抑制細胞與細胞外基質的黏附，但兩者對結直腸癌生長的影響尚不十分清楚。本研究觀察了Fumagillin和Cyclo對小鼠結直腸癌生長及血管新生的影響，以闡明Fumagillin抑制血管新生的分子機制，對Fumagillin處理后臍帶靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）基因表達的變化用基因芯片的方法做了檢測。

1 材料和方法

1.1 細胞系及動物 中分化大腸腺癌細胞系WiDr和高分化大腸腺癌細胞系HT-29均得自ATCC（Rockville，MD，USA）。Fumagillin和Cyclo購自Sigma公司。20只SCID小鼠被分為4組，分別為Fumagillin處理組、Cyclo處理組、聯(lián)合處理組及對照組，每組5只。WiDr或HT-29細胞以5×105/L共計200μL的量接種于小鼠背部皮下，放置4周后，分別從隔日腹腔內(nèi)注射Fumagillin（0.1 mg/kg）和（或）Cyclo（1 mg/kg），注射持續(xù)4周，對照組注射同等體積的二甲基亞砜（DMSO）。藥物注射結束后處死動物，測量原發(fā)瘤質量。原發(fā)瘤制成冰凍切片，并行CD105免疫組織化學染色，計數(shù)CD105陽性的微血管數(shù)量。CD105多表達于活化的內(nèi)皮細胞上，更能準確反映新生血管的數(shù)量［8］。同時在體外培養(yǎng)WiDr和HT-29細胞，向培養(yǎng)基內(nèi)加入Fumagillin（0.01 mg/L）和（或）Cyclo（0.1 mg/L），用DNA合成檢測試劑盒（Roche Diagnostics，Penzberg，Germany）檢測此兩種藥物對腫瘤細胞增殖的直接影響。

1.2 HUVECs的培養(yǎng)及增殖檢測 按照Piao等［9］的方法從臍帶靜脈分離培養(yǎng)內(nèi)皮細胞，向培養(yǎng)基內(nèi)加入Fumagillin（0.01 μg/mL）和（或）Cyclo（0.1 μg/mL），藥物作用24 h后用加入5-Bromo-2-deoxy-uridine（BrdU，10 μmol/L）再培養(yǎng)1 h，然后按照DNA合成檢測試劑盒（Roche diagnostics）說明書上記載的方法檢測HUVECs的增殖情況。RGE肽是與Cyclo序列近似而不具有Cyclo生物學功能的寡肽，在本實驗中被用作Cyclo的陰性對照。

1.3 HUVECs的體外微管形成檢測 用底面鋪了50 μm Matrigel（BD Bioscience，Bedford，MA，USA）的24孔板檢測HUVECs形成微管的情況。HUVECs被以104個細胞/cm2的量加入24孔板的孔中，在含體積分數(shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后在光鏡下觀察微管形成的變化，微管的長度用NIH Image program（HYPERLINK； http://rsb.info.nih.gov/nihimage）測量。

1.4 Human 13K cDNA芯片檢測 HUVECs被暴露于Fumagillin（0.01 μg/mL）24 h后，提取Fumagillin處理后和未處理細胞的總RNA，再從RNA中用mRNA純化試劑盒（Amersham Biosciences， Buckinghamshire，UK）分離mRNA。用CyScribe First-strand cDNA labeling kit（Amersham Biosciences，San Francisco，CA，USA） 逆轉錄合成熒光標記探針，與Human 13K cDNA芯片競爭雜交。雜交后芯片在ScanArray 4000 laser scanner system（Packard Biochip Tech，Billerica，MA，USA）上掃描定量化。Fumagillin處理后表達上調一倍或下調一半以上的基因被認為基因表達是被改變的。

1.5 定量PCR檢測 為驗證基因芯片的結果，用實時定量PCR（LightCycler Real-time PCR detection System，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany）的方法檢測HUVECs的cyclin E2， 白細胞活化黏附因子（activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM）和 細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1，CD54）3個基因在Fumagillin處理前后的表達變化。PCR引物序列如下：Cyclin E2: forward 5’-CCTGATTTAAGCTGGGGATG-3’； reverse 5’-TGCAAGCACCATCAGTGAC-3’。BC020729.1（358～377 bp，706～688 bp，PCR產(chǎn)物 348 bp）。 ALCAM: forward 5’-GCTAGTAACTGAGGACAACGTG-3’；reverse 5’-GAGCTTCTTATTCCTTCGGGCTG-3’。 NM001627.2（882～903 bp，1424～1402 bp，PCR產(chǎn)物 542 bp）。 ICAM-1:forward 5’-CGACTGGACGAGAGGGATTG-3’；reverse 5’-TTATGACTGCGGCTGCTACC-3’。BT006854.1（1189～1208 bp，1477～1458 bp PCR產(chǎn)物 288 bp）。

以Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（G3PDH）基因作為內(nèi)參照。

1.5 免疫印跡檢測 用免疫印跡法檢測ICAM-1和CyclinE2的蛋白表達水平。常規(guī)電泳分離蛋白之后，將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，然后分別與Cyclin E2（A-9）和ICAM-1（G-5）特異性抗體4℃過夜反應后（均為鼠抗人的單克隆抗體，Santa Cruz Biotechnology），再與結合了過氧化物酶的（peroxidaseconjugated） 二抗 （兔抗鼠 IgG， Doko cytomation）反應。最后用ECL-增強化學發(fā)光試劑盒（ECL-enhanced chemiluminescence kit，Amersham Biosceiences）顯色，顯色后的硝酸纖維素膜在化學發(fā)光檢出器上檢測（Luminescentt iimm--age analyzer LAS-1000 Plus，F(xiàn)ujifilm，Tokyo，Japan）。Vimentin基因被用作內(nèi)參照。

2 結 果

2.1 腫瘤質量及瘤內(nèi)微血管密度的檢測結果 本研究使用皮下移植瘤小鼠模型來檢測Fumagillin對結直腸癌生長的影響。與對照組相比，Cyclo處理組在腫瘤質量和MVD-CD105上差異無統(tǒng)計學意義，而Fumagillin處理組與對照組相比腫瘤質量和MVD-CD105顯著減少（P＜0.05）（圖1，2）。聯(lián)合處理組與FFuummaa--gillin處理組相比在腫瘤質量上呈輕度下降的趨勢，但這種差異不具有顯著性。WiDr和HT-29細胞系在體外也被直接暴露于Fumagillin或Cyclo下，然后用DNA合成試劑盒檢測腫瘤細胞的增殖率，處理前后的腫瘤細胞增殖率未見明顯變化（圖3）。

2.2 HUVECs增殖抑制試驗結果 本研究采用BrdU摻入的方法檢測HUVECs增殖，與對照組相比，F(xiàn)umagillin或Cyclo處理后的HUVECs增殖率明顯下降，而Fumagillin和Cyclo聯(lián)合處理后HUVECs的增殖率較單獨處理顯著下降（P＜0.05）（圖4）。

2.3 HUVECs體外微管形成抑制試驗結果HUVECs可在Matrigel上形成微管樣網(wǎng)絡，與對照組相比Fumagillin處理后微管長度下降了44.6%；Cyclo處理后微管長度下降了41.0%；而兩藥聯(lián)合處理后微管長度下降了78%（圖5）。

2.4 Fumagillin處理前后的基因表達變化本研究使用了一含有13 000個基因的基因芯片檢測Fumagillin處理前后HUVECs基因表達的變化，結果發(fā)現(xiàn)Fumagillin處理后HUVECs有71個基因表達上調和143個基因表達下調，表達變化的基因多與細胞黏附、移動、增殖和基因轉錄有關。代表性的基因變化見表1。

2.5 定量PCR和免疫印跡法驗證基因芯片的結果 為驗證基因芯片檢測結果的準確性，本研究用定量PCR法檢測了CyclinE2，ALCAM和ICAM-1的基因表達水平；用免疫印跡法檢測了ALCAM和ICAM-1的蛋白表達水平。定量PCR和免疫印跡法所獲結果與基因芯片結果一致：Fumagillin處理后CyclinE2，ALCAM和ICAM-1的表達受到抑制（圖6，7）。

3 討 論

圖1 煙曲霉素和(或)Cyclo對結直腸癌生長的抑制作用Fig.1 Effects of Fumagillin and/or Cyclo on colorectal tumor growth

圖2 煙曲霉素和(或)Cyclo對結直腸癌血管新生的抑制作用Fig.2 The effects of Fumagillin and/or Cyclo on colorectal tumor angiogenesis

圖3 煙曲霉素和(或)Cyclo對結直腸癌細胞增殖的直接影響Fig.3 Direct effect of Fumagillin and Cyclo on proliferation of colorectal tumor cells

圖4 煙曲霉素和(或)Cyclo對臍帶靜脈內(nèi)皮細胞增殖的直接影響Fig.4 Suppression of HUVEC proliferation by Fumagillin and Cyclo

圖5 煙曲霉素和(或)Cyclo對HUVECs微管形成的直接影響Fig.5 Effects of Fumagillin and Cyclo on HUVEC tube formation

表1 Fumagillin處理后 HUVECs 的基因表達變化Tab.1 Up- or down-regulated expression gene in HUVECs by Fumagillin

圖6 ICAM-1、ALCAM和cyclin E2的定量PCR結果Fig.6 Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) results for cyclin E2, ICAM-1 and ALCAM

圖7 ICAM-1和cyclin E2的免疫印跡檢測結果Fig.7 Western blotting result of ICAM-1 and cyclin E2

抗血管新生療法是腫瘤治療的新戰(zhàn)略之一，F(xiàn)umagillin及其合成抑制物可以在體內(nèi)和體外抑制血管新生［10-11］。Fumagillin可使內(nèi)皮細胞增殖停滯在細胞周期的G1期。MetAp-2可催化N末端蛋氨酸殘基的轉移，為內(nèi)皮細胞的增殖是必須［12］。Gervaz等［13］發(fā)現(xiàn)TNP-470處理后的DHDK12細胞的增殖和轉移受到抑制，他們推測這種抑制是因血管新生和直接細胞毒作用合并的結果。Ogawa等［14］用TNP-470和氟尿嘧啶（5-fluorouracil）聯(lián)合處理結直腸癌細胞的增殖，獲得了明顯的細胞毒作用。但他們采用的劑量非常大，而這種劑量是很難應用于臨床的。在本研究中，我們使用很低的劑量也明顯地抑制了高、中分化結直腸癌細胞系的增殖和腫瘤內(nèi)CD105陽性新生血管的增加。Fumagillin和Cyclo聯(lián)合處理組在腫瘤生長抑制上較單獨處理組更為有效，但因實驗動物數(shù)量的限制，這種差異未達統(tǒng)計學意義。在體外HUVECs的增殖和微管形成被Fumagillin或Cyclo明顯抑制，而兩藥聯(lián)合處理較單獨處理更為有效。體外Fumagillin處理結直腸癌細胞并不改變癌細胞的增殖率，這些結果提示Fumagillin可能通過抑制結直腸癌的血管新生來抑制結直腸癌的增殖。

雖然現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MetAp-2是Fumagillin作用的分子靶標，但以小干擾RNA技術抑制MetAp-2表達后的內(nèi)皮細胞依然對Fumagillin的生長抑制作用有反應［15］。這些結果說明FFuu--magillin抑制血管新生的分子機制尚不完全清楚。該文作者采用cDNA芯片技術對Fumagillin誘導的HUVECs的基因表達變化做了檢測，發(fā)現(xiàn)表達被改變的基因多與基因轉錄、細胞黏附、移動和增殖有關。

表達被下調的一個基因是Cyclin E2。Cyclin E2表達在細胞周期G1期的晚期［16］，Cyclin E2與CDK2形成功能復合物，Cyclin E2的表達與細胞通過G1期密切相關。在一個b-catenin誘導的血管新生模型中，內(nèi)皮細胞的高增殖與內(nèi)皮細胞高表達Cyclin E2有關［17］。本實驗中Cyclin E2的mRNA和蛋白質表達明顯被Fumagillin抑制，這可能部分地解釋了為什么Fumagillin可以使內(nèi)皮細胞的增殖停滯在G1期。另外一個表達被下調的基因是ICAM-1，其在內(nèi)皮細胞上表達，可介導內(nèi)皮細胞和白細胞的黏附［18］。VEGF-A刺激后內(nèi)皮細胞的ICAM-1表達上調，提示ICAM-1亦可能參與血管新生的調節(jié)［19］。ALCAM（CD166）是一種細胞黏附分子，亦表達在內(nèi)皮細胞上，并可介導同種細胞間的黏附，近來胚胎發(fā)育過程中內(nèi)皮細胞和造血細胞內(nèi)ALCAM的表達被檢測，并被推測其的表達與血管新生有關［20］。本研究中內(nèi)皮細胞的微管形成被Fumagillin抑制可能與ICAM-1和ALCAM的表達下調有關。除了Cyclin E2、ICAM-1和ALCAM之外，F(xiàn)umagillin還抑制了其他一些與內(nèi)皮細胞增殖和分化有關基因的表達。

總之，F(xiàn)umagillin可能是結直腸癌的有效治療藥物，F(xiàn)umagillin通過抑制血管新生抑制結直腸癌增殖，而Cyclin E2、ICAM-1和ALCAM的表達下調可能與Fumagillin抑制血管新生有關。

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