尹利華 劉純青 曾亮 孟秀香

1.湖南懷化醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，湖南 懷化 418000；2.大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044；3.湖南省腫瘤醫(yī)院病理科，湖南 長(zhǎng)沙 410013

黑色素瘤（malignant melanoma, MM）是來(lái)源于黑色素細(xì)胞的一種侵襲力強(qiáng)、轉(zhuǎn)移性高、進(jìn)展迅速且預(yù)后極差的高度惡性腫瘤。其發(fā)病率在近二十年中成倍增長(zhǎng)［1］。多梳基因家族的Bmi-1被認(rèn)為是一種原癌基因，參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成。現(xiàn)有眾多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示Bmi-l在多種腫瘤中均有高表達(dá)［2-3］。但有關(guān)Bmi-l與黑色素瘤的研究較少。p16基因是近年發(fā)現(xiàn)的直接參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖負(fù)調(diào)控的抑癌基因［4］。本研究旨在檢測(cè)黑色素瘤組織中Bmi-1及p16蛋白的表達(dá)水平，及其與黑色素瘤臨床病理特征的關(guān)系，并研究二者在黑色素瘤中表達(dá)的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集2003年—2007年期間湖南省腫瘤醫(yī)院病理科保存的黑色素瘤石蠟標(biāo)本35例，另選14例皮內(nèi)痣樣本作為良性對(duì)照。所有組織HE切片經(jīng)兩位病理醫(yī)生讀片（雙盲法）以及HMB45、S-100蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)確診。在35例黑色素瘤患者中，男性14例，女性21例；年齡18～83歲，平均51.1歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，死亡7例；根據(jù)病理（Clark標(biāo)準(zhǔn)）分級(jí)：Ⅰ級(jí)7例，Ⅱ級(jí)7例，Ⅲ級(jí)4例，Ⅳ～Ⅴ級(jí)17例。皮內(nèi)痣組男性4例，女性10例；年齡14歲～53歲，平均38.1歲。所有標(biāo)本均經(jīng)4%的甲醇溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚做連續(xù)切片，室溫保存。

1.2 試劑及方法 二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化處理，3%H2O2溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS緩沖液（pH7.4）洗片，檸檬酸緩沖液（pH6.0）抗原修復(fù)液常規(guī)修復(fù)：微波爐中750 W 12 min，冷卻3 min，750 W 12 min加熱以充分暴露抗原位點(diǎn)。待自然冷卻后，加封閉液室溫封閉30 min，分別滴加鼠抗人Bmi-1多克隆抗體（l∶100稀釋液，Abcam USA）及鼠抗人P16單克隆抗體工作液（l∶150稀釋液, Santa Cruz USA），4 ℃溫育過(guò)夜。PBS緩沖液沖洗，分別加二抗（羊抗鼠，北京中杉公司SP試劑盒）37 ℃溫育60 min，PBS緩沖液沖洗，滴加S-A/HRP液（北京中杉公司SP試劑盒），室溫溫育30 min，PBS緩沖液沖洗，用新鮮配置的DAB溶液顯色。鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，自來(lái)水終止顯色，用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。實(shí)驗(yàn)分別用已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替2種一抗為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組織化學(xué)法染色陽(yáng)性反應(yīng)為顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜、細(xì)胞核呈棕黃色。每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)染色陽(yáng)性細(xì)胞所占細(xì)胞的百分比及染色強(qiáng)弱程度，將結(jié)果分為：＜5%為(-)，6%～30%為(+)，31% ～60%為(++)，＞60%為(+++)，將(++～+++)定為中高表達(dá)，將(-～+)定為低表達(dá)。如果陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，但染色強(qiáng)度較弱者，相應(yīng)降低一級(jí)。以上結(jié)果至少由兩位病理科醫(yī)生在雙盲情況下獨(dú)立觀片后統(tǒng)一所得。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，黑色素瘤與皮內(nèi)痣組的組間差異采用卡方統(tǒng)計(jì)分析；Bmi-1與p16間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bmi-1和p16蛋白在黑色素瘤組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，Bmi-1和p16均主要表達(dá)在細(xì)胞核，表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，也有少量表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)。本組35例黑色素瘤中Bmi-1陽(yáng)性表達(dá)率為63%（22/35），中高陽(yáng)性表達(dá)率為51%（18/35），14例皮內(nèi)痣中Bmi-1陽(yáng)性表達(dá)率為71%（10/14），中高陽(yáng)性表達(dá)率為14%（2/14）?？梢?jiàn)Bmi-1蛋白在黑色素瘤組織中的中高陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于皮內(nèi)痣組（χ2=5.711，P＜0.05），而兩組間的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.056，P＞0.05）。p16在35例黑色素瘤中陽(yáng)性表達(dá)為17%（6/35），中高陽(yáng)性表達(dá)為6%（2/35）；14例皮內(nèi)痣中p16陽(yáng)性表達(dá)率為93%（13/14），其中中高陽(yáng)性達(dá)71%（10/14）?？梢?jiàn)p16蛋白在黑色素瘤中陽(yáng)性及中高陽(yáng)性表達(dá)率均明顯低于皮內(nèi)痣組（陽(yáng)性率：χ2=24.15，P＜0.01；中高陽(yáng)性率：χ2=19.93，P＜0.01）。

2.2 Bmi-1和P16蛋白表達(dá)與黑色素瘤臨床病理征的關(guān)系 為觀察臨床各因素對(duì)Bmi-1及p16表達(dá)的影響，本研究分析了患者的性別、年齡、腫瘤體積大小、發(fā)病部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級(jí)與Bmi-1、p16的相關(guān)性。結(jié)果顯示，p16與6個(gè)臨床因素都無(wú)相關(guān)性，而B(niǎo)mi-1的表達(dá)與病理分級(jí)關(guān)系密切，即Ⅲ、Ⅳ級(jí)黑色素瘤Bmi-1的陽(yáng)性表達(dá)率（67%）明顯高于Ⅰ、Ⅱ級(jí)黑色素瘤（29%）（P＜0.05)，但與其他5個(gè)因素則不存在明顯的相關(guān)性（表1）。

2.3 黑色素瘤中Bmi-1蛋白表達(dá)與p16蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，黑色素瘤組織中Bmi-1與p16表達(dá)無(wú)相關(guān)性（r=0.239，P＞0.05，表2）。

圖1 黑色素瘤組織中Bmi-1、p16蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of Bmi-1 and p16 proteins in malignant melanoma tissues(SP×400)

表1 黑色素瘤組織中Bmi-1、p16蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Correlation between the clinical pathologic features and the expression of Bmi-1 and p16 protein in malignant melanoma n(%)

表2 黑色素瘤組織中Bmi-1蛋白與p16蛋白的相關(guān)性Tab.2 Correlation of the expression of the Bmi-1 to p16 protein in malignant melanoma tissues

3 討 論

Bmi-1是新近發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期有負(fù)調(diào)節(jié)作用的癌基因，屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子polycomb家族?，F(xiàn)已確定人類Bmi-1基因位于第10號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶（10p13），含10個(gè)內(nèi)含子和10個(gè)外顯子。編碼含326個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)氨基酸序列與鼠的一致性達(dá)98%?，F(xiàn)認(rèn)為Bmi-1在細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控作用主要是通過(guò)調(diào)控其下游p16ink4a/Arf位點(diǎn)而進(jìn)行的，該位點(diǎn)通過(guò)不同的啟動(dòng)子分別編碼p16ink4a和p19Arf蛋白。Bmi-l即通過(guò)調(diào)節(jié)該位點(diǎn)編碼的腫瘤抑制因子p16ink4a和p19Arf的表達(dá)來(lái)控制細(xì)胞的增殖和衰老。

本研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1在黑色素瘤組織中的中高陽(yáng)性表達(dá)較皮內(nèi)痣組明顯增強(qiáng)（51% vs 14%，P＜0.05），但中高陽(yáng)性略低于Kim等［3］的研究結(jié)果，提示Bmi-1高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展關(guān)系密切。本研究結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)顯示，Bmi-1 蛋白高表達(dá)率與患者性別、年齡、腫瘤大小、分布部位及是否淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05），而與病理分級(jí)相關(guān)，病理分級(jí)中的Ⅲ/Ⅳ期的患者Bmi-1蛋白表達(dá)高于Ⅰ/Ⅱ期患者（P＜0.05）。顯示Bmi-1基因可能在黑色素瘤的發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要作用。提示有可能作為臨床監(jiān)測(cè)病情的一個(gè)重要指標(biāo)。但本研究樣本例數(shù)較少，臨床資料不太完善亦可能對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果有影響，這需要本課題組在以后的研究中進(jìn)一步完善。

有關(guān)Bmi-1在黑色素瘤中的表達(dá)目前存在不一致的證據(jù)。Mihic-Probst等［5］研究表明，與原發(fā)性黑色素瘤相比，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤Bmi-1表達(dá)顯著增高（P=0.001）；而B(niǎo)achmann等［6］研究顯示，黑色素瘤中Bmi-1表達(dá)較良性組織下降，且Bmi-1缺失表達(dá)與腫瘤的侵襲性有關(guān)。本研究結(jié)果傾向于支持Mihic-Probst等［5］的結(jié)論，即Bmi-1在黑色素瘤中表達(dá)增高。本研究認(rèn)為Bmi-1基因介入了黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制，其高表達(dá)很可能起著促進(jìn)腫瘤增殖的作用。

Mouriaux等［7］在脈胳膜黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)60%的病例p16呈陰性表達(dá)，本研究顯示黑色素瘤組p16陽(yáng)性表達(dá)率及中高陽(yáng)性表達(dá)率較皮內(nèi)痣組明顯降低（陽(yáng)性率：17% vs 93%，P＜0.01；中高陽(yáng)性率：6% vs 71%，P＜0.01）。p16蛋白高表達(dá)率與患者性別、年齡、腫瘤大小、分布部位、病理分級(jí)及是否淋巴轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05），提示黑色素瘤的發(fā)生可能與p16表達(dá)下降有關(guān)。近年有研究者將外源性p16基因轉(zhuǎn)染p16基因缺失的腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)p16的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［8］，這是p16抑制腫瘤生長(zhǎng)的直接證據(jù)，也是證明p16缺失可誘發(fā)癌癥的間接證據(jù)。因此，黑色素瘤中p16表達(dá)的降低，可減弱其對(duì)CDK4的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。本研究對(duì)Bmi-1與p16在黑色素瘤中的表達(dá)作了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者并不存在相關(guān)性。

綜上所述，由于p16的變異或不穩(wěn)定表達(dá)可存在Bmi-1與p16不相關(guān)的情況，一方面提示p16的降低并不是由Bmi-1的高表達(dá)引起的，另一方面也說(shuō)明Bmi-1可通過(guò)其他機(jī)制作用于腫瘤細(xì)胞。

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