趙西耀,陳煜森,何芳梅,趙磊,劉梁芳,潘劍罡,趙斌

Htra2(High temperature requirement A2),也稱作Omi,是Htra絲氨酸蛋白酶家族的一個新成員,在大部分的正常組織器官中都有其表達。該基因位于人類染色體2p13.1。Htra2是一類較為特殊的蛋白質,它既具有誘導凋亡的蛋白酶活性,同時還是分子伴侶,具有細胞保護作用。Htra2既可以通過氨基末端的Reaper樣基序[Ala-Val-Pro-Ser(AVPS)]與凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)相互作用來誘導凋亡,亦可以通過caspase非依賴性,即直接利用其蛋白酶活性發(fā)揮促凋亡作用[1]。推測Htra2缺乏時將導致機體發(fā)育過程中某些應該凋亡消失的細胞不能夠自然崩解而致病[2]。另一方面,Krick等通過H tra2基因靶向刪除等方法發(fā)現,鼠對氧化應激反應更敏感,推測Htra2在神經元內的主要角色可能是對抗應激的神經保護作用,并認為Htra2發(fā)揮抗凋亡或促凋亡活性,取決于所在的亞細胞結構和相互作用蛋白,在線粒體中以抵抗氧化應激的細胞保護作用為主;在胞漿中,以誘導細胞凋亡作用為主[3]。

自1977年發(fā)現內含子以來,內含子功能的研究一直受到人們的關注。在許多基因的內含子中均發(fā)現基因表達的調控元件,其中大多為增強元件,可以調控轉錄的起始來增強基因的表達;此外,一些內含子在基因的表達中起抑制作用;一些基因的內含子突變會引起基因表達效應的變化。單核苷酸多態(tài)性是一種重要的遺傳標記。已經發(fā)現Htra2基因多個單核苷酸多態(tài)性位點與帕金森病相關[4-5]。Htra2基因內含子5-59A/G(rs2241027)位點的多態(tài)性(等位基因為A和G)與帕金森病關系的研究在國內外尚未見報導。我們在粵西地區(qū)漢族人群中檢測Htra2基因內含子5-59A/G位點頻率的分布特點,并分析其基因多態(tài)性與帕金森病的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2004年3月～2008年9月本院神經內科住院的帕金森病患者56例作為病例組,其中男性35例,女性21例;年齡50～89歲,平均(67.91±9.80)歲。均為粵西地區(qū)的漢族人。所有病例均按照2006年中華醫(yī)學會神經病學分會帕金森病及運動障礙學組討論決定的帕金森病診斷標準進行選擇,并排除非帕金森病的診斷。本院健康體檢者109例作為對照組,其中男性68例,女性 41例;年齡52～86歲,平均(68.62±8.31)歲。均為漢族人,無帕金森病病史。兩組間男女比例(P=0.627)、平均年齡(P=0.627)均無顯著性差異。

所有標本的收集均經其本人或家屬同意,并經廣東醫(yī)學院醫(yī)學研究倫理委員會同意。

1.2 DNA的提取和Htra2基因的分型 取早晨空腹靜脈血5 ml,3.8%檸檬酸鈉抗凝,碘化鉀法提取外周血白細胞的DNA。用聚合酶鏈反應-限制性酶切片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法檢測病例組和對照組全部樣本Htra2基因內含子5-59A/G位點的多態(tài)性。根據5-59A/G位點及其兩側的DNA序列用Primer 5.0引物設計軟件設計引物,用 NEBcutter V2.0設計Bsp1268I限制性內切酶,根據酶切片段條帶的不同分析其基因型和多態(tài)性。

引物由上海生工合成,上游引物:5′-TGT GGG AAG GGT AGG TT-3′,下游 引物 :5′-GGA TGG CAA AGG AGA TT-3′。PCR反應體系 13.02 μL,其中包括 10×Buffer 1.15 μL,dNTP(10 mmol/L)1.0 μL,引物(20 μ mol/L)0.25 μL,基因組 DNA 1.0 μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.12 μL,H2O 9.25 μL。PCR 反應條件:94℃,熱變性5 min,94℃45 s,退火54.6℃44s,延伸72℃42 s,擴增32個循環(huán)后延伸72℃10 min,終止反應 。取 PCR 擴增產物 2 μL、NEB Buffer 0.5 μL、Bsp1268I 0.25 μL、三蒸水 2.25 μL,使總體系為5 μL,30℃酶切7 h,進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。100 V電泳4 h后用銀染法染色,觀察結果。含有Htra2基因5-59A/G的PCR產物是241 bp,經Bsp1268I酶消化后產生兩個片段分別是 123 bp和118 bp兩端大小片斷。雜合子AG基因型則有3個片段,分別為241 bp、123 bp和 118 bp;純合子AA 基因型則只有1個片斷,大小241 bp;純合子GG基因型有2個片斷:123 bp和118 bp。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件和遺傳學數理統(tǒng)計方法對所有資料進行統(tǒng)計分析。基因型和等位基因頻率采用直接計數法統(tǒng)計。研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度、基因型和等位基因頻率的組間比較采用四格表χ2檢驗,計量資料用兩樣本均數t檢驗分析,顯著性水平α=0.05。

2 結果

Htra2基因內含子5-59A/G位點上從A到G的突變產生了Bsp1268I限制性內切酶的酶切位點。酶切該多態(tài)性位點的PCR產物后電泳圖如下。

圖1 5-59A/G位點擴增片段 Bsp1286I酶切產物電泳圖

病例組(χ2=0.091,P=0.956)與對照組(χ2=0.920,P=0.337)人群中Htra2基因內含子5-59A/G位點的基因型分布經Pearson χ2檢驗均符合Hardy-Weinberg平衡,表明Htra2基因內含子5-59A/G位點的基因型分布在所研究的人群中已達到了遺傳平衡。病例組和對照組 3種基因型頻率分別是:AA:21.4%(12/56),AG:50.0%(28/56),GG:28.6%(16/56)和AA:11.0%(12/109),AG:51.4%(55/109),GG:37.6%(42/109)。AA基因型及等位基因A與帕金森病均有相關傾向。見表1。

表1 兩組Htra2基因內含子5-59A/G位點多態(tài)性[n(%)]

經性別分層后,男性病例組A等位基因頻率略高于對照組(P=0.051),OR=1.788,95%CI:0.994～3.217。病例組AA基因型頻率高于對照組(P=0.041),OR=0.332,95%CI:0.112～0.985。在女性中,病例組的A等位基因頻率與對照組無顯著性差異(P=0.681),OR=1.172,95%CI:0.551～2.494。GG基因型也無顯著性差異(P=0.657),OR=1.296,95%CI:0.412～4.077。見表2。

表2 兩組不同性別5-59A/G位點多態(tài)性[n(%)]

3 討論

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是常見于中老年人的進行性神經系統(tǒng)變性疾病,以黑質多巴胺能神經元變性缺失和路易小體形成為特征。帕金森病病因迄今不明,目前普遍認為多種因素可能參與帕金森病的發(fā)病,遺傳因素可使患病易感性增加。Htra2作為一種核編碼線粒蛋白酶,在內質網中合成,在線粒體膜間隙儲存。當細胞受到刺激發(fā)生應激反應時,線粒體膜通透性增加,Htra2分子從線粒體釋放并進入細胞質和/或細胞核中。在胞質中,它通過N端4殘基IAP結合要區(qū)結合IAP的桿狀病毒IAP重復結構域,通過破壞caspase-IAP復合物,和/或誘導IAPs的自動泛素化和降解,促進了caspase-3、7、9活性,因而解除了IAPs對caspases的阻止,誘發(fā)凋亡。同時還可借自身的酶活性切割、降解 IAPs[6]。另外,Htra2還具有caspase非依賴的致凋亡作用[1],其作用機制還有待研究。另外,通過Htra2基因靶向刪除、轉基因表達、免疫印跡、測定細胞膜電位等方法,發(fā)現鼠Htra2基因靶向刪除對氧化應激反應更敏感,與對照組比較更易誘導細胞凋亡。神經元特異性Htra2過表達的轉基因鼠并沒有出現神經元凋亡增加,也并未出現表型異常,推測Htra2在神經元內的主要角色可能是對抗應激的神經保護作用[3]。近來還發(fā)現其對Parkin相關的泛素蛋白酶體有重要的影響[7],及參與氧化磷酸化過程[8]。

近年來,其基因突變與帕金森的相關性研究成亦受到了人們的重視。Strauss等對414例帕金森患者和331例健康人的G421T多態(tài)性相關性研究發(fā)現,病例組中有26例雜合子個體(6.2%),對照組中只有10例(3%),并驗證了A141S基因多態(tài)性與帕金森病呈顯著性相關(P＜0.05),同時沒有發(fā)現突變的純合子攜帶者;相比之下,在4個散發(fā)性的帕金森病患者中得到確認的G1195A的替代,在健康對照的740條同源染色體中卻沒有發(fā)現。他們還在原發(fā)性帕金森病患者大腦Lewy小體中檢測到了Htra2分子;同時觀察到編碼Htra2的基因發(fā)生突變時,引起了與帕金森病特征相同的神經變性[4]。Bogaerts等通過突變分析等方法驗證了 Htra2的 PDZ區(qū)域的一個新的突變位點Arg404Trp,該位點的突變預測將失活Htra2。通過熒光素酶報告基因分析的數據,測序等方法,在可能影響Htra2表達的5′和 3′區(qū)域,驗證了 6個患者特異性突變體,并推測此突變可能影響了其轉錄活性[5]。但也有無相關性的報道[9]。實驗結果不一致可能是由于種族、地區(qū)、試驗方法、結果的判定等因素的差異引起。

近年來,人們對內含子的功能提出許多新的見解[10]:①內含子通過啟動子、起始位點的堿基配對,可以阻止或增強RNA聚合酶的作用;②內含子具有各種剪接信號,不同的細胞可以選擇不同的拼接點,對外顯子進行有選擇地拼接,形成不同的成熟mRNA;③內含子也許有自已特定的蛋白質編碼。內含子可以對基因表達起增強或抑制作用。

本研究所選Htra2基因5-59A/G位點處從G到A的突變導致了Bsp1268I酶的限制性酶切位點。我們檢測了粵西地區(qū)56例帕金森患者和109例健康人的H tra2基因內含子5-59A/G位點的基因型,分析其基因型和等位基因頻率分布以及它們與帕金森病之間的關聯性。結果顯示,H tra2基因內含子5-59A/G位點的AA基因型及等位基因A與帕金森病均有相關傾向;在經過性別分層后,男性AA基因型與帕金森病具有相關性,而Htra2基因5-59A/G多態(tài)性與女性帕金森病發(fā)病無關。結合內含子的功能特點,推測該位點與帕金森病的相關性可能是通過影響基因分子構象轉錄時剪切位置,和/或影響與相應蛋白結合,進而影響基因轉錄的起始和延伸等過程,影響了Htra2的蛋白酶活性,最終促進了帕金森病的發(fā)生。相關性局限于男性,可能因性激素等引起。尚有待進一步研究證實。

本研究的樣本較小,其代表性與普通人群可能有差異,因此有必要對 Htra2基因位點內含子4之5-59A/G位點進一步深入研究,以正確評價其多態(tài)性在帕金森病中的作用機制和臨床應用價值。

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