趙曉宇，馮興軍，孟利強，張淑梅，王玉霞，張先成

（1.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱 150030）

傳統(tǒng)抗生素的應(yīng)用所具有的負面效應(yīng)日益嚴重?？股氐臑E用所產(chǎn)生的諸如對人類的危害、細菌耐藥性的增強和耐藥菌株的增加、對環(huán)境的潛在危害等問題已受到全世界的關(guān)注?？咕氖菣C體在受到病原體感染時產(chǎn)生的一類小分子多肽。它作為一種先天性免疫因子，在保護機體免受病原體侵害方面具有重要作用，且不易產(chǎn)生菌株耐藥性[1]。牛乳鐵蛋白活性多肽（LfcinB）最先是由Bellamy等于1992年在牛乳鐵蛋白的酶解產(chǎn)物中分離得到的一段N端多肽，其抗菌活性比牛乳鐵蛋白高400多倍[1-2]。LfcinB位于牛乳鐵蛋白的17～41位氨基酸殘基之間，由25個氨基酸殘基組成，分子結(jié)構(gòu)以兩親性的β-折疊為主。LfcinB具有廣譜抗菌活性[3]、強大的抑菌殺菌作用[4-5]、、抗病毒[6]、抑制腫瘤生長[7-8]、調(diào)節(jié)免疫及消炎[9]、抗寄生蟲[10]等多種生物學功能。LfcinB在醫(yī)藥、保健、食品保鮮等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛。然而，來源上的限制阻礙了LfcinB的應(yīng)用發(fā)展?；蚬こ碳夹g(shù)為解決LfcinB來源問題提供了有效手段。本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)高效表達了LfcinB，為重組表達LfcinB提供技術(shù)路線和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

質(zhì)粒pGEX-4T-2（購于Amersham公司）；E.coli DH5α 感受態(tài)細胞和 E.coli Rosetta（DE3）（購于北京全式金公司）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923）由本實驗室保存。

1.1.2 試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ和SalⅠ（購于NEB公司），T4DNA連接酶（購于寶生物公司）；DNA分子質(zhì)量標準、蛋白分子質(zhì)量標準（購于北京全式金公司）。DNA酶（購于Sigma公司）；異丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp）、還原型谷胱甘肽（L-glutathion reduced）（購于Sigma公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（購于北京全式金公司）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（購于Qiagen公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器設(shè)備：UVP Auto Chemi System凝膠成像系統(tǒng)（美國），分析軟件LabWorks 4.6，BIORADMINI電泳儀，魧KTApurifier蛋白純化系統(tǒng)（美國），GSTrap FF 1 mL親和層析柱（美國），McFarland Standard比濁管（法國）。

1.2 方法

1.2.1 基因的設(shè)計與合成

LfcinB的氨基酸序列為Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe，根據(jù)E.coli密碼子偏愛性設(shè)計合成編碼LfcinB 25個氨基酸的基因片段[11]，同時在基因3'端加上終止密碼子TAA，分別在兩端加上Bam H I與Sal I的粘性末端。整個基因的正鏈為5'GATCCTTCAAATGCCGC CGTTGCAGTGCGTATGAAAAAACTGGGTCGCCGTC TATTACCTGCGTGCGTCGCGCGTTCTAAG 3'，反鏈為5'TCGACTTAGAACGCGCGACGCACGCAGGTAA TAGACGGCGCACCCAGTTTTTTCATACGCCACTGC CAACGGCGGCATTTGAAG 3'。化學合成正反鏈，退火，連接到pGH的Bam H I與Sal I位點之間，構(gòu)建克隆載體pGH-X-LCB[12]。

1.2.2 原核重組表達載體的構(gòu)建

用Bam HⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒pGH-X-LCB，回收基因片段連接到原核表達載體pGEX-4T-2的Bam HⅠ和SalⅠ位點之間，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-2-LCB，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)雙酶切鑒定篩選得到陽性克隆，并將陽性克隆送至上海生工生物工程公司測序驗證。

1.2.3 原核表達

重組表達載體pGEX-4T-2-LCB轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta（DE3），挑取陽性菌落轉(zhuǎn)接于5 mL含50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)過夜。同時接種含母本pGEX-4T-2載體的轉(zhuǎn)化菌作對照。吸取500 μL菌液轉(zhuǎn)接入50 mL含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600=0.6左右，加IPTG至終濃度為0.3 mmol·L-1，在33℃誘導4 h。取1 mL菌液，加入等體積的上樣緩沖液100℃煮沸5 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清，15%SDS-PAGE分析?？捡R斯亮藍染色、脫色后，用UVP AutoChemi System凝膠成像系統(tǒng)拍照，LabWorks4.6軟件測定表達蛋白的相對含量。

1.2.4 融合蛋白的純化

1.2.4.1 樣品制備

將含有陽性重組子pGEX-4T-2-LCB E.coli Rosetta（DE3）按照上述條件誘導后，5 000 r·min-1離心10 min收集菌體；按100 mL培養(yǎng)物的菌體沉淀加入4 mL PBS重懸菌體，-20℃冷凍后，冰浴融解；加入溶菌酶至終濃度1 mg·mL-1，冰上放置30 min；加入Triton X-100至0.1%，震蕩混勻；加入DNA酶和RNA酶至終濃度5 μg·mL-1，4℃溫浴10 min；加入DTT至終濃度1 mmol·L-1，4 ℃12 000 r·min-1離心30 min，收集上清備用。

1.2.4.2 GST-LfcinB融合蛋白純化

上清液中的GST-LfcinB融合蛋白通過GST標簽親和層析進行分離純化。上樣體積：100 μL。純化條件：流速 0.5 mL·min-1，壓力 0.25 MPa，Binding Buffer（1× PBS ：140 mmol·L-1NaCl，2.7 mmol·L-1KCl，10 mmol·L-1Na2HPO4，1.8 mmol·L-1KH2PO4，pH 7.3）。處理預(yù)裝柱，UV280調(diào)零，基線穩(wěn)定后上載樣品，待流出峰經(jīng)過，基線完全回歸零點后更換 Elution Buffer（50 mmol·L-1Tris-HCl，10 mmol·L-1還原性谷胱苷肽，pH 8.0）進行洗脫?；厥障疵摲鍢悠方?jīng)SDS-PAGE電泳分析，具體方法參照文獻[12]。樣品制備參照文獻[13]。

1.2.5 抗菌肽的活性測定

將金黃色葡萄球菌于MH液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，比濁測定菌數(shù)固定在6×108～9×108之間，涂布在MHB固體培養(yǎng)基表面，待菌液吸干后取滅菌紙片放置于培養(yǎng)基上，每個試驗紙片滴加10 μL純化后的LfcinB重組蛋白，37℃過夜培養(yǎng)，觀察是否有抑菌圈。對照為滅菌水。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒的提取及酶切

質(zhì)粒pGH-X-LCB以及酶切后的產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，得到清晰的DNA條帶，大小與預(yù)計結(jié)果相同，凝膠回收試劑盒回收目的片段，與表達載體pGEX-4T-2連接后轉(zhuǎn)化DH5α。

2.2 重組表達載體的構(gòu)建

牙簽挑取陽性克隆，在LB液體培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，用Bam HⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，結(jié)果見圖2。在經(jīng)過雙酶切后樣品2中在84 bp處存在一清晰條帶。經(jīng)過測序驗證，重組質(zhì)粒中含有LfcinB基因片段，與設(shè)計的基因片段完全吻合。

圖1 質(zhì)粒pGH-X-LCB、pGEX-4T-2質(zhì)粒及其酶切電泳Fig.1 Electrophoresis analysis of plasmid pGH-X-LCB,pGEX-4T-2 and digested products

圖2 質(zhì)粒pGEX-4T-2-LCB的酶切驗證Fig.2 Electrophoresis analysis of plasmid pGEX-4T-2-LCB digested by Bam H I and Sal I

2.3 原核表達

誘導表達后的樣品經(jīng)SDS-PAGE分析，如圖3所示。樣品1在29 ku處存在一條蛋白條帶，為GST-LfcinB融合蛋白。通過凝膠分析軟件Lab-Works 4.6對工程菌株裂解上清液中蛋白含量進行測定，結(jié)果表明所表達的融合蛋白占總蛋白含量的20%以上，并且所表達的蛋白多為可溶性形式。

圖3 LfcinB融合蛋白在E.coli Rosetta（DE3）中的誘導表達Fig.3 Induced expression of LfcinB fusion protein in E.coli Rosetta(DE3)

2.4 融合蛋白的純化

利用GE魧KTA蛋白分離純化系統(tǒng)對表達的融合蛋白GST-LfcinB進行親和層析純化，洗脫曲線如圖4所示。共獲得P1、P2和P33個洗脫峰，其中P1和P2為流出峰，P3則為洗脫峰。將洗脫峰進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖5所示。收集獲得的樣品在29 ku位置有一清晰條帶，為純化后的GST-LfcinB融合蛋白，其純度高于95%。

圖4 融合蛋白GST-LfcinB的洗脫曲線Fig.4 Eluting curve of fusion protein GST-LfcinB

圖5 純化蛋白電泳Fig.5 Electrophoresis analysis of purified fusion protein GST-LfcinB

2.5 抗菌肽的活性測定

將經(jīng)過GE魧KTA蛋白分離純化系統(tǒng)純化獲得的融合蛋白GST-LfcinB，進行體外活性測定，結(jié)果如圖6所示。利用紙片薄層瓊脂糖平皿擴散法測定重組LfcinB抗菌活性。在金黃色葡萄球菌生長的平板上，試驗孔明顯出現(xiàn)抑菌圈，而對照孔菌株生長正常，表明重組的LfcinB具有抗菌活性。

圖6 重組LfcinB對金黃色葡萄球菌（S.aureas ATCC25923）的抑菌活性Fig.6 Antimicrobial activity of recombinant LfcinB to Staphylococcus aureas ATCC25923

3 討論與結(jié)論

獲得目的基因有多種方法，但多數(shù)費時耗力。目前DNA合成儀能夠精確合成人們需要的目的核苷酸片段，為獲得目的基因提供了一條新途徑。因此，人們可以根據(jù)研究要求設(shè)計、合成具有更加實際應(yīng)用價值與研究價值的編碼基因。合成基因片段的長度從FcyRIIb1基因的幾百堿基到IL-2基因的上千堿基不等[14-15]，并且已經(jīng)試驗證明合成的基因能夠成功表達。因此，人工合成基因的方法避免了以往傳統(tǒng)基因克隆方法獲得的目的基因片段容易產(chǎn)生的堿基錯配以及獲得目的基因費時、費力的弊端，可以快速獲得任意核苷酸序列的目的基因片段。本研究獲得的LfcinB編碼基因長度僅為75 bp，使用人工合成的方法不僅能夠快速獲得該基因片段、節(jié)約試驗耗材，而且通過該方法成功地優(yōu)化了原有的密碼子，使得該基因能夠更好的表達，并且在大腸桿菌中不形成包涵體，主要以可溶性蛋白為主，為蛋白后期分離純化打下了良好的基礎(chǔ)。

誘導條件對重組蛋白表達有顯著影響，誘導溫度、IPTG濃度以及誘導表達時間是主要的影響條件，本研究針對三種影響因素對誘導條件進行了優(yōu)化，獲得了合適的誘導表達條件。在優(yōu)化的誘導條件下，IPTG濃度0.3 mmol·L-1，表達溫度33℃，誘導時間4 h，GST基因融合表達系統(tǒng)成功表達了LfcinB，獲得了理想的表達效果，誘導蛋白表達量占細胞總蛋白的20%以上，并且所表達的融合蛋白大部分以可溶性形式存在，避免了繁瑣復(fù)雜的包涵體處理操作過程，可溶性表達方式存在的蛋白可以直接利用親和層析進行純化獲得融合蛋白，方便了進一步的分離純化過程。

本研究利用GE魧KTApurifier蛋白純化系統(tǒng)結(jié)合GST親和層析預(yù)裝柱成功從裂解液上清中純化出LfcinB重組融合蛋白，分離純化條件穩(wěn)定，純化效率高，回收率大，對目標蛋白無影響。純化目標蛋白純度在95%以上，達到了極好的分離效果。

*馮興軍為本文的同等貢獻者。

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