劉 彤，楊國慧，夏筱麗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

黑穗醋栗屬于茶藨子科（Grossulariaceae）茶藨子屬（Ribes L.），是一種有特色的寒地小漿果類果樹，在其生長過程中，易受到真菌病和多種病毒病的危害。在真菌病害中，白粉病、葉斑病和銹病是黑穗醋栗的主要病害[1-2]。近年來，葉斑病在黑龍江省和新疆黑穗醋栗栽植區(qū)的發(fā)生越來越普遍，而且逐漸加重，嚴(yán)重地影響了植株的營養(yǎng)生長和株叢產(chǎn)量。關(guān)于黑穗醋栗葉斑病，國外的研究報(bào)道認(rèn)為引起葉斑病的病原主要有兩種[2]：①褐斑病病原菌（Gloesporium ribis），屬于半知菌亞門（Deuteromycetes）盤圓孢屬（Gloesporium）；②白斑病病原菌（Septoria ribis），屬于半知菌亞門（Deuteromycetes）殼針孢屬（Septoria）。國內(nèi)只是對其發(fā)病癥狀有過記載[3]，對病原的研究尚未見報(bào)道。本研究的主要目的就是通過在黑龍江省黑穗醋栗的主要栽植區(qū)采集病樣，進(jìn)行分離、純化和鑒定葉斑病的病原菌，以期為生產(chǎn)上防治該病害及黑穗醋栗的抗葉斑病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病樣分別采自于黑龍江省海林市、樺川縣、賓縣和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站。

1.2 病原菌的分離、純化及初步鑒定

田間采集典型發(fā)病的病葉，制成臨時(shí)切片，于顯微鏡下觀察分生孢子器及分生孢子的形態(tài)；同時(shí)用清水將病葉沖洗干凈，采用組織分離法對病斑進(jìn)行分離，直到獲得純化的病原菌，觀察并記載病原菌的菌落特征。挑取少量純化后的菌絲及孢子，于顯微鏡下觀察形態(tài)，根據(jù)有關(guān)資料進(jìn)行病原菌所屬種的鑒定[4]。

挑取部分純化后菌絲轉(zhuǎn)到斜面馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（Potato carrot agar，PCA）上，冰箱冷鮮層中保存，備用。

1.3 病原菌適宜培養(yǎng)基的篩選

選擇在PDA上生長良好的菌落，在菌落邊緣用無菌的打孔器打成直徑6 mm菌餅，分別置于4種平板培養(yǎng)基：PDA、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基、燕麥片培養(yǎng)基和含有黑穗醋栗葉片汁液培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)3次。其中前3種培養(yǎng)基的配制方法參見文獻(xiàn)[4]。含有黑穗醋栗葉片汁液培養(yǎng)基的配制為：鮮葉片100 g（磨成汁液），葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。每隔1 d十字交叉法測量菌落直徑，第6天到第12天，每隔1 d采用血球計(jì)數(shù)板法測產(chǎn)孢量。

1.4 接種及病原菌的再分離、鑒定

根據(jù)柯赫法則進(jìn)行病原物的接種。取自然產(chǎn)孢較好的菌落，刮下表面產(chǎn)生的大量分生孢子，用無菌水稀釋離心后制成孢子懸浮液（1×106個(gè)·mL-1）。分別接種在4～5葉期的黑穗醋栗苗上和離體葉片上。接種方法：①噴霧接種：用小型噴霧器將孢子懸浮液直接噴到苗期葉片上；②摩擦接種：葉片用細(xì)目金剛砂摩擦后用棉花蘸取孢子懸浮液涂抹；③菌餅接種，用打孔器打成直徑6 mm菌餅，菌面朝下反接在苗期葉片上。

按照上述方法接種后置于人工氣候培養(yǎng)箱中，套袋保濕24 h，接種期間環(huán)境條件為光照條件28℃、14 h，無光條件20℃、10 h，以噴清水為對照，逐日觀察并記錄。對接種后發(fā)病的葉片進(jìn)行病原菌的再分離和鑒定，方法同1.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑穗醋栗葉斑病田間表現(xiàn)

發(fā)病初期為6月下旬，盛期為7月中下旬。病害傳播非?？?，4～6 d即可全園不同程度感病。田間表現(xiàn)為：最初在下層葉片上形成淺褐色水漬狀小斑點(diǎn)，組織變薄（對著光線看半透明）。病害迅速向上發(fā)展，形成圓形或有棱角的褐色斑點(diǎn)。病斑邊緣呈深褐色，內(nèi)部較淺，直徑1～5 mm。后期病斑轉(zhuǎn)為淺灰色或灰白色，中間出現(xiàn)小的黑色小球狀（球似體）分生孢子器。嚴(yán)重時(shí)多個(gè)病斑匯合成片，形成不規(guī)則的大片枯斑，導(dǎo)致葉片失綠、卷曲，提前脫落（見圖1）。

圖1 病害田間癥狀Fig.1 Symptom of blackcurrant leaf spot in field

2.2 葉斑病病原菌的分離、純化和初步鑒定

研究結(jié)果表明，在PDA上，菌落圓形，培養(yǎng)初期氣生菌絲白色，平鋪呈絨毛狀，邊緣光滑。菌落生長較快，后期菌落呈土黃色，從中心向外緣逐漸變淡，有蘑菇的氣味；菌絲體呈樹杈狀伸展，白色，有隔膜；分生孢子器球形或近球形，器壁暗褐色，膜質(zhì)（見圖2）；分生孢子線形，無色透明，正直或彎曲，基部近截形，頂端略尖，1～3個(gè)隔膜，大小為（35～50）μm×（1.5～2.5）μm（見圖 3）。根據(jù)以上特征并參考文獻(xiàn)[5-6]，確定分離的病原菌為殼針孢屬（Septoria），屬于半知菌亞門（Deuteromycetes）球殼孢目（Sphaeropsidales）球殼孢科（Sphaeropsidaceae）。

圖 2 分生孢子器（×400）Fig.2 Pycnidium of Septoria sp.from blackcurrant

圖3 分生孢子（×400）Fig.3 Conidia of Septoria sp.from blackcurrant

2.3 不同培養(yǎng)基對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

病原菌在4種培養(yǎng)基上均可生長，其中在PDA上生長最好，顏色均勻、菌絲緊密，產(chǎn)孢量好，培養(yǎng)6 d菌落直徑達(dá)90.0 mm，12 d產(chǎn)孢量達(dá)到8.55×106個(gè)·mL-1。燕麥片培養(yǎng)基和玉米粉瓊脂培養(yǎng)基次之，菌落直徑和產(chǎn)孢量分別為88.3 mm，4.40×106個(gè)·mL-1和 81.8 mm，3.80×106個(gè)·mL-1。病原菌在含有黑穗醋栗汁液的培養(yǎng)基上生長較弱，6 d菌落直徑僅為55.0 mm，并且不產(chǎn)生孢子（見表 1）。

2.4 病原菌的接種、再分離與鑒定

人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)的接種試驗(yàn)結(jié)果表明，利用4～5片葉的黑穗醋栗苗為接種材料，采用摩擦接種1個(gè)多月左右，葉片正面出現(xiàn)黃綠色近圓形的斑點(diǎn)，半透明，稍后斑點(diǎn)變褐，癥狀與田間觀察到的初期癥狀一致，而其他方法均未表現(xiàn)出癥狀。對接種后的發(fā)病葉片鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)無色透明的線形孢子，符合柯赫定律，由此再次證明引起黑穗醋栗葉斑病的病原菌為殼針孢屬（Septoria）真菌。

表1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Table 1 Effect of different medium on pathogen growth and number of sporification

3 討論

白俄羅斯的研究結(jié)果認(rèn)為，黑穗醋栗葉斑病主要有兩種：①褐斑?。褐饕Y狀為在葉片形成小的、不清晰的、不規(guī)則的黑褐色斑點(diǎn)，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)斑點(diǎn)連接起來，葉片變褐、干枯、邊緣向上卷曲。引起褐斑病的病原菌屬于半知菌亞門（Deuteromycetes）盤圓孢屬（Gloesporium），其有性階段為子囊菌亞門（Ascomycetes）假盤孢屬（Pseadopeziza）；②白斑?。褐饕Y狀為在葉片上形成多數(shù)的淺灰色帶有褐色邊緣的圓形或角形斑點(diǎn)，在斑點(diǎn)上形成黑色的小球狀分生孢子器。引起白斑病的病原菌屬于半知菌亞門（Deuteromycetes）殼針孢屬（Septoria），其有性階段為子囊菌亞門（Ascomycetes）球腔菌屬（Mycosphaerella）。其研究結(jié)果表明，上述兩種病原菌有性孢子形成的高峰期在冬春凍融交替季節(jié)。褐斑病菌只侵染葉片，而白斑病菌除侵染葉片外，還侵染葉柄、果實(shí)和幼枝[2]。本研究在采集病樣時(shí)也觀察到了上述兩種癥狀，但是在采集的病樣中只鑒定出了殼針孢屬（Septoria）真菌。此外通過對病樣連續(xù)取樣觀察（一直到冬春凍融交替季節(jié)，冬季取田間落葉），尚未觀察到病原菌的有性階段以及白斑病病原菌侵染葉柄、果實(shí)和幼枝，分析原因可能是不同的品種、不同的氣候條件導(dǎo)致病原菌的種類、病害的發(fā)展規(guī)律有所不同，同時(shí)也說明今后還應(yīng)持續(xù)開展黑穗醋栗葉斑病的研究工作，特別是要加強(qiáng)對病害發(fā)生規(guī)律的研究。

目前國外對黑穗醋栗葉斑病的防治除了加強(qiáng)果園管理，如清掃病葉、合理施肥外，主要是采用藥劑防治。藥劑的防治主要在以下三個(gè)時(shí)期進(jìn)行：有性孢子散發(fā)期、無性孢子散發(fā)期和果實(shí)采收后，而且強(qiáng)調(diào)生物藥劑的使用[2]。選育抗病品種是預(yù)防病害最切實(shí)有效的途徑，但目前國外對選育抗性品種的報(bào)道不多，而且被鑒定的材料高抗褐斑病和白斑病的品種很少[7-13]。為了選育抗病品種，今后的工作應(yīng)廣泛收集黑穗醋栗種質(zhì)資源并進(jìn)行抗性鑒定，為此還必須建立快速有效的人工接種方法。Лозовская對接種方法進(jìn)行了研究，認(rèn)為摩擦接種的效果好于不摩擦接種，而且只摩擦葉柄洼處的接種效果要好于整個(gè)葉片摩擦接種[2]。本研究對接種方法也進(jìn)行了初步摸索，從研究結(jié)果看也是采用摩擦接種效果較好，但還存在發(fā)病時(shí)間長、效果不是特別明顯的問題，可能是由于人工氣候箱內(nèi)的條件和自然條件有差異的緣故，另外也進(jìn)行了只摩擦葉柄洼處的接種試驗(yàn)，但是植株沒有發(fā)病，所以今后還應(yīng)進(jìn)行快速接種方法的篩選工作。此外，在選育抗源材料時(shí)除對現(xiàn)有的品種、品系篩選外，也要從我國豐富的茶藨子屬（Ribes L.）野生資源中篩選。

4 結(jié)論

本研究得出如下結(jié)論：在黑龍江省引起黑穗醋栗葉斑病的病原為殼針孢屬（Septoria）真菌，適于該病原菌生長的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

[1] 何康.中國農(nóng)業(yè)百科全書/果樹卷[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1993:565.

[2] Лo3obckaЯ Р И.Особенности развития антракноза и септориоза черной смородины и обоснование приемов ее защиты[D].п.Прилуки Минской области:Белорусский научноисследовательский институт плодоводства академии аграрных наук республики Беларусь,1996.

[3] 張鳳英.草莓、黑豆果、樹莓病蟲害防治[M].哈爾濱:黑龍江人民出版社,1988:50-54

[4] 方中達(dá).植病研究方法[M].3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1998:78-83.

[5] 戴芳瀾.真菌的形態(tài)和分類[M].北京:科學(xué)出版社,1987:272-273.

[6] 白金鎧.中國真菌志(第十七卷)球殼孢目[M].北京:科學(xué)出版社,2003:489.

[7] 丁曉東.小漿果育種[M].長春:吉林科學(xué)技術(shù)出版社,1995:129-131.

[8] 楊國慧,張仲凱,崔崇士.云南、黑龍江兩省南瓜主要病毒病原種類鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,38(1):23-26.

[9] 夏筱麗,楊國慧,睢薇.黑穗醋栗癭螨的危害及防治[J].中國果樹,2007(1):38-39.

[10] Stanys,Staniene V,Shikshnianas G,et al.Interspecific hybridization in Ribes genus[J].Acta Horticulturae.2004(663):861-864.

[11] ИcaЧКИН А В. Ягодные культуры[M].Москва:Лик пресс,2001:68-74.

[12] ЕpemИh Г В.Общая и частная селекция и сортоведение плодовых и ягодных культур [M].Москва: Мир,2004:375-385.

[13] ЗaЗyЛИha Н А.Селекция смородины черной в Беларуси[J].Плодоводство/Белорус НИИ плодоводства,2000,13:112-115.