張 偉,任素芳,田振宇,鄭彤彤,張秀美,徐懷英

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山東 濟(jì)南 250100;2.山東澳蘭生物工程研究院,山東 青島 266101)

近年來(lái),禽的病毒病變得更加復(fù)雜,混合感染﹑交叉感染已成為目前疾病的顯著特征,本研究旨在現(xiàn)有探針?lè)聪嚯s交技術(shù)的基礎(chǔ)上融合基因芯片的基本原理,將導(dǎo)致雞產(chǎn)蛋下降的常見(jiàn)6種病原的高度保守片段(探針)用物理和化學(xué)的方法固定在硝酸纖維膜上,制成臨床診斷用低密度基因芯片。現(xiàn)將研究情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要毒株與試劑 NDV(F48E9)、H9(A/Chicken/Guangdong/SS/94)、IBV(M41)、EDS-76(B4)、ILT(Blen)、MG(NB72)均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;裂解液、(預(yù))雜交液、雜交洗滌液、底物液、酶聯(lián)緩沖液、顯色底液由研究室配制[1]。

1.2 6種病原探針引物的設(shè)計(jì) 寡核苷酸引物根據(jù)GenBank中已發(fā)表的序列分別查找到NDV、AIV 、IBV 、EDS76、ILT 、MG 多條全長(zhǎng)序列,使用DNAStar分析每種病毒的高度保守序列[2-3]。用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)合適的引物見(jiàn)表1。

1.3 6種病原探針質(zhì)粒的克隆構(gòu)建 提取6種病原的核酸擴(kuò)增、純化與pMD18-T載體連接,隨后轉(zhuǎn)入JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,篩選重組克隆質(zhì)粒[3]。

1.4 基因芯片的制備 將核酸探針進(jìn)行純化并定量稀釋到100 ng/μL,用微量點(diǎn)樣器點(diǎn)在預(yù)處理的硝酸纖維素膜上[4]。在電熱鼓風(fēng)干燥箱中80℃烤膜2 h,完成基因芯片的制備。

表1 DNA陣列引物序列

1.5 檢測(cè)樣品的制備和標(biāo)記 取預(yù)處理的組織勻漿液采取堿裂解的方法提取核酸。將6種病原混合引物(各20 pmol/μ L)加入反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄中加生物素Bio-11-dUTP進(jìn)行標(biāo)記[5]。

1.6 基因芯片雜交和芯片掃描雜交結(jié)果的分析參照文獻(xiàn)[1]的方法進(jìn)行(預(yù))雜交。雜交完畢的芯片用掃描儀進(jìn)行掃描分析,根據(jù)樣品的分析設(shè)置:讀數(shù)0.1以下為陰性,0.2以上為陽(yáng)性,兩者之間為可疑[6]。

圖1 芯片掃描儀下的芯片整理數(shù)據(jù)

1.7 基因芯片的靈敏度檢測(cè) 為了檢驗(yàn)本研究所建立方法的靈敏性,將NDV的感染尿囊液作10-1～10-10倍比稀釋,分成3份,一份做芯片檢測(cè),一份做RT-PCR,另一份做病毒分離。

1.8 基因芯片的特異性試驗(yàn) 將6種混合引物同時(shí)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),依次減少一種引物進(jìn)行芯片的特異性試驗(yàn)。

1.9 基因芯片的動(dòng)物試驗(yàn)和臨床中試 將20只120日齡SPF雞隨機(jī)分成2組,每組10只,分別接種低致病性AIV H9。死雞及時(shí)送檢觀察病變,取心 、肝、脾、肺 、腎、胸肌 、腿肌 、翅肌、氣管、直腸、骨髓組織勻漿提取核酸。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果 芯片靈敏度高于RT-PCR和病毒分離,分別為RT-PCR和病毒分離的104倍和105倍。RT-PCR檢測(cè)雞胚感染尿囊液的最高稀釋度為10-7,病毒分離檢測(cè)雞胚感染尿囊液的最高稀釋度為10-8,而芯片可檢測(cè)到的最高稀釋度為10-11,見(jiàn)表 2和圖2。

表2 新城疫芯片靈敏度試驗(yàn)

圖2 基因芯片的靈敏度檢測(cè)

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 6種混合引物同時(shí)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),依次減少的種毒核酸時(shí)進(jìn)行芯片檢測(cè),各芯片上特異性雜交點(diǎn)呈強(qiáng)陽(yáng)性,非目的性雜交點(diǎn)為陰性。

2.3 動(dòng)物試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 在不同的組織勻漿液中提取的核酸芯片檢測(cè),基因芯片的靈敏度明顯高于RT-PCR和病毒分離,分別為病毒分離、RT-PCR的102和103倍。見(jiàn)表3。

2.4 臨床試驗(yàn)結(jié)果 自2007年2月起開(kāi)始應(yīng)用以來(lái),諸城綠安有限公司和濟(jì)寧天諾雅動(dòng)物保健有限公司集中做試點(diǎn),經(jīng)對(duì)918例各種死淘病雞的檢測(cè),檢出雞新城疫病毒感染的雞158例,傳染性支氣管炎病毒的病雞108例,雞減蛋綜合征病毒43例,低致病性禽流感病毒11例,雞毒支原體病14例,其中混合感染109例。

3 討論

本試驗(yàn)采用基因芯片的基本原理,建立了檢測(cè)致雞產(chǎn)蛋下降疾病低密度基因芯片技術(shù)平臺(tái)。通過(guò)試驗(yàn)證明,此項(xiàng)技術(shù)可對(duì)常見(jiàn)雞產(chǎn)蛋下降疾病做出迅速、準(zhǔn)確、并行的鑒別。通過(guò)特異性試驗(yàn)證明,此技術(shù)特異性良好。和其他病原無(wú)交叉反應(yīng),且芯片上不同病原間也無(wú)交叉反應(yīng),試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。本試驗(yàn)方法采用雜交顯色技術(shù),對(duì)結(jié)果也可目測(cè)判定,生產(chǎn)成本僅為數(shù)萬(wàn)元,更有利于普及和推廣[7]。

表3 芯片檢測(cè)AIV感染動(dòng)物試驗(yàn)

[1]馬立人,蔣中華.生物芯片[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:101-260.

[2]殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997.

[3]Joseph Sambrook,David W Russell.Molecular cloning:A Laboratory Manual[M].3rd ed.Publishiing Company of Science,2002:85-98.

[4]Cheng J,Xing W.T he Fronriers of Biochip Technology[M].New York:U.S.A.Kluwer Academic Publishers,2005.

[5]張偉,吳時(shí)友,尹燕博,等.狂犬病診斷基因芯片的建立和檢測(cè)應(yīng)用的初步研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,30(2):136-140.

[6]Xing W,Cheng J.Experiments in Biochip Technologies[M].T singhua University Press,2006:184-193.

[7]Saif Y M.Diseases of Poultry[M].11st ed.Beijing:Publishiing China Agricultural University Press,2005.