宋銘忻,路義鑫,王守育,張子群,暢 丹,韓彩霞

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局,黑龍江 哈爾濱 150030)

旋毛蟲(Trichinella spiralis)是一種感染宿主骨骼肌細(xì)胞的寄生蟲。旋毛蟲新生蚴鉆入宿主骨骼肌細(xì)胞后,會(huì)導(dǎo)致其去分化,從而改造肌細(xì)胞,使之形成保姆細(xì)胞(nurse cell,NC)。保姆細(xì)胞可為旋毛蟲提供營(yíng)養(yǎng),并具有免疫逃避的作用。許多學(xué)者認(rèn)為旋毛蟲保姆細(xì)胞的形成與旋毛蟲43 ku～50 ku排泄-分泌(ES)抗原有關(guān)[1]。Ts43基因是43ku ES抗原蛋白的表達(dá)基因,其全長(zhǎng)cDNA由美國(guó)研究者Vassilatis D K(1992)首先發(fā)現(xiàn),為旋毛蟲肌幼蟲特異性表達(dá)基因[2]。本研究通過熒光定量PCR技術(shù)對(duì)旋毛蟲各時(shí)期蟲體Ts43基因表達(dá)進(jìn)行定量分析,從而進(jìn)一步探討Ts43基因與保姆細(xì)胞形成的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 蟲種和質(zhì)粒 旋毛蟲蟲種、質(zhì)粒pMD18-TTs43和pMD18-T-18S為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲病學(xué)教研室保存。

1.2 熒光定量PCR引物和探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的旋毛蟲Ts43和18S rRNA(登錄號(hào)分別為M95499和U60231)序列,設(shè)計(jì)并合成引物和探針:

Ts43的引物序列和探針為FP:5′-ACAT TT TTCTTAGTGCTT TCTGGGT-3′;RP:5′-ACCATTCTGTATCATCTGTAGCAGTTCT-3′;PROBE:5′-TGCACAACTGTTTGCAAATTCATGCAGC-3′。

18S rRNA的引物序列和探針為 FP:5′-AGGTTCGAAGGCGATCAGATAC-3′;RP:5′-CTGCTCG CCGAGTCTTAAATG-3′;PROBE:5′-CCAACCAGC-GAT TCGCCGAAGT-3′。

1.3 旋毛蟲不同寄生時(shí)期蟲體的收集 參考文獻(xiàn)[3-4]的方法,在小鼠感染旋毛蟲肌幼蟲7 d后收集成蟲(AW),并取適量成蟲體外培養(yǎng)收集新生蚴(NBL),于感染后14、18 d和22 d收集成囊前期幼蟲(PEL),于感染后 26、30、34、38、48 d 和 58 d 收集旋毛蟲肌幼蟲(ML)。將收集到的旋毛蟲各時(shí)期蟲體,用DEPC水洗滌3次,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 旋毛蟲總RNA和cDNA文庫的制備 旋毛蟲總RNA抽提按試劑盒說明進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后做18S rRNA的PCR,判斷逆轉(zhuǎn)錄是否成功。

1.5 熒光定量PCR靈敏性、穩(wěn)定性和重復(fù)性的檢測(cè) 對(duì)1ng的pMD18-T-Ts43和pMD18-T-18S質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,分別用熒光定量PCR檢測(cè),根據(jù)Ct值來檢測(cè)方法的靈敏性。對(duì)10-3ng的標(biāo)準(zhǔn)品分別做5個(gè)反應(yīng)管檢測(cè)比較同一次反應(yīng)不同反應(yīng)管間的批內(nèi)變異及重復(fù)5次檢測(cè)比較不同時(shí)間的反應(yīng)結(jié)果的批間變異。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及 Ts43基因的表達(dá)水平的檢測(cè) 用紫外分光光度計(jì)測(cè)質(zhì)粒 pMD18-T-Ts43和pMD18-T-18S的濃度后取1 ng/μ L的質(zhì)粒依次進(jìn)行10倍的梯度稀釋,分裝為10-1～10-5ng/μ L作為標(biāo)準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)品的起始拷貝數(shù)取對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo),其所對(duì)應(yīng)的Ct值作為縱坐標(biāo),即可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將旋毛蟲各時(shí)期蟲體的cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR,獲取相應(yīng)的Ct值。根據(jù)Ct值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算定量結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 旋毛蟲各時(shí)期蟲體cDNA的PCR鑒定 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果顯示,旋毛蟲各時(shí)期蟲體的18S rRNA目的片段均在100 bp略下方,與設(shè)計(jì)的內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物91 bp大小一致(見圖1)。

圖1 各寄生時(shí)期蟲體cDNA文庫的PCR鑒定

2.2 熒光定量PCR的靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的檢測(cè) 質(zhì)粒pMD18-T-T s43和pMD18-T-18S的檢測(cè)下限均為 10-8ng/μ L。對(duì) 10-3ng/μ L的質(zhì)粒pMD 18-T-Ts43作5個(gè)反應(yīng)管檢測(cè),同一次反應(yīng)不同反應(yīng)管的批內(nèi)變異系數(shù)為2.0%,不同時(shí)間的反應(yīng)結(jié)果的批間變異系數(shù)為3.5%,說明本方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性都很好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 T s43基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-3.390X+13.451,一致系數(shù)為 0.999;18S rRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=-3.246X+16.396,一致系數(shù)為0.992。結(jié)果顯示兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率都接近理想值-3.322,一致系數(shù)都接近1.000,說明擴(kuò)增效率均較好(見圖2和圖3)。

2.4 旋毛蟲各時(shí)期蟲體Ts43基因表達(dá)水平的檢測(cè) 根據(jù)Ct值計(jì)算出旋毛蟲各時(shí)期蟲體T s43基因相對(duì)于107copies 18S rRNA的拷貝數(shù)(見表1)。旋毛蟲在各寄生時(shí)期均有Ts43基因的表達(dá),成蟲和新生蚴的Ts43基因表達(dá)量相對(duì)于其他寄生時(shí)期的蟲體很低,該基因表達(dá)量在感染后18 d開始逐漸上升,于感染后30 d達(dá)到高峰,而后開始逐漸下降,但至感染后58 d的蟲體T s43基因表達(dá)水平仍高于成蟲和新生蚴。

表1 不同寄生時(shí)期旋毛蟲Ts43基因的定量

3 討論

許多學(xué)者在研究旋毛蟲保姆細(xì)胞的形成機(jī)制時(shí),都注意到了ES抗原的重要作用。Despommier D等[5]用層析聚焦法在 ES抗原中發(fā)現(xiàn)了一種43 ku蛋白,它存在于感染后9 d的保姆細(xì)胞的胞漿、核質(zhì)以及表皮上,表明其參與肌肉細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。Vassilaits D K等[6]制備了具有螺旋-環(huán)-螺旋樣結(jié)構(gòu)的43 ku重組蛋白抗原,認(rèn)為其可能具有調(diào)節(jié)宿主骨骼肌細(xì)胞基因表達(dá)的功能。Jasmer D P等[7]構(gòu)建了旋毛蟲43 ku蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pMYCTsp43,并轉(zhuǎn)染到鼠成肌細(xì)胞C2C12,結(jié)果表明該表達(dá)質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染的成肌細(xì)胞具有明顯的毒性而無去分化作用。在這之前,Vassilaits D K等[6]也認(rèn)為43 ku蛋白并沒有直接參與旋毛蟲保姆細(xì)胞的形成,而是與43 ku蛋白相關(guān)的一系列蛋白參與了骨骼肌的去分化和保姆細(xì)胞的形成。至今關(guān)于43 ku蛋白是否與保姆細(xì)胞的形成有關(guān)還在爭(zhēng)論中。

宋銘忻等[8]認(rèn)為旋毛蟲在小鼠骨骼肌中最早形成保姆細(xì)胞時(shí)間在感染后16 d,于感染后37 d所有肌幼蟲都形成保姆細(xì)胞。本研究結(jié)果表明,T s43基因的表達(dá)量正是在感染后18d開始增加,在感染后30 d達(dá)到峰值,隨后開始逐漸下降,到感染后38 d之后表達(dá)量基本維持在一個(gè)相對(duì)較低的水平,這與保姆細(xì)胞形成的時(shí)間基本一致[8]。這一現(xiàn)象說明Ts43基因的表達(dá)很可能與保姆細(xì)胞的形成有關(guān)系。此外,本研究中的Ts43基因在成蟲和新生蚴中也有少量的表達(dá),這與之前報(bào)道的Ts43基因表達(dá)具有期特異性有所不同[6,9]。Vassilaits D K等[6]采用RT-PCR的方法檢測(cè)感染旋毛蟲肌幼蟲后9、10、11 、12、13、14 、15 d 和 21 d 的小鼠骨骼肌 ,在感染后11 d才發(fā)現(xiàn)T s43基因的表達(dá)。Wu Z L等[9]采用半定量RT-PCR法對(duì)旋毛蟲的成蟲、新生蚴進(jìn)行基因定量,發(fā)現(xiàn)成蟲、新生蚴都無Ts43基因的表達(dá)。出現(xiàn)上述不同的試驗(yàn)結(jié)果可能與各自所用的研究方法、儀器設(shè)備和引物等因素有關(guān),這還有待做進(jìn)一步的深入研究。

總之,本研究結(jié)果可以初步確定T s43基因的表達(dá)與保姆細(xì)胞的形成有較大關(guān)系,為進(jìn)一步研究Ts43基因表達(dá)對(duì)小鼠骨骼肌細(xì)胞基因的影響提供了理論基礎(chǔ)。

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