宇文延青,高玉龍,高宏雷,祁小樂,林 歡,王笑梅

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150001;2.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453007)

雞傳染性貧血(CIA)是由雞傳染性貧血病毒(CAV)引起的一種以再生障礙性貧血和淋巴器官組織萎縮為主要特征的免疫抑制病。崔現(xiàn)蘭(1992)首次于我國東北地區(qū)分離到該病毒[1],目前在我國許多地方都有該病毒的報道。CAV侵入雛雞體內(nèi)后,主要作用于骨髓和胸腺等淋巴器官,導(dǎo)致感染雞出現(xiàn)再生障礙性貧血及胸腺等淋巴器官嚴重萎縮,產(chǎn)生免疫抑制,對禽病疫苗的免疫應(yīng)答機能降低,甚至喪失。為研究雞傳染性囊病病毒對雞傳染性囊病活疫苗(Gt株)免疫效果的影響,本試驗采用人工感染CAV的方法研究CAV感染對雞傳染性囊病活疫苗(Gt株)免疫效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雞傳染性貧血病毒(M9905株)由本實驗室分離鑒定保存;IBDV超強毒Gx株由本實驗室保存,雞傳染性囊病活疫苗(Gt株)購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司(批號:200724);雞傳染性囊病病毒抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司(批號:5040.00);1日齡SPF雛雞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供;基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司;PCR儀由 TaKaRa公司生產(chǎn);TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase為TaKaRa(大連)公司產(chǎn)品。

1.2 試驗分組 將80羽1日齡白來航SPF雛雞隨機分為Gx株攻毒對照組(A)、CAV感染組(B)、Gt株免疫組(C)、CAV感染-Gt株免疫組(D)和陰性對照組(E),每組16羽,飼養(yǎng)于負壓隔離器中。

1.3 攻毒與免疫接種 B組和D組在雛雞1日齡時肌肉注射感染CAV-M9905,每羽0.1mL(雛雞半數(shù)感染量CID50=94.5/0.2mL)。在雛雞7日齡時,用雞傳染性囊病活疫苗(Gt株)口服免疫C組和D組,免疫劑量按說明書要求,同時,E組注射滅菌PBS。在雛雞 28日齡時用 IBDV超強毒 Gx株(ELD50=102.72/0.1mL)對 A、B、C和D組攻毒,0.1mL/羽(10 ELD50),攻毒后連續(xù)觀察1周,直至無死亡雞出現(xiàn)為止,記錄試驗結(jié)果并計算。

1.4 引物設(shè)計 根據(jù)CAV-Cux-1株VP2基因(約650 bp序列(GenBank登錄號:M55918),利用Oligo6.0軟件設(shè)計1對引物,引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。上游引物CP1:5′-GCggatccATGCACGGGAACGGCGGAC-3′,下游引物 CP2:5′-CGGgtcgacTCACACTATACGTACCGG-3′(其中,小寫字母為BamH Ⅰ和SalⅠ酶切位點)。

1.5 雞傳染性貧血病毒PCR檢測 7日齡時每組隨機抽取1羽雛雞采集肝臟,研磨之,用試劑盒提取CAV基因組,進行PCR擴增并進行檢測,PCR條件為:94℃4 min,94℃45 s,58℃45 s,72℃45 s,35個循環(huán),72℃10 min,4℃保溫。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠檢測。

1.6 血樣采集與抗體檢測 在雛雞14、20、28日齡對C、D兩組采血,每組5羽,按常規(guī)方法收集血清,用ELISA試劑盒對IBDV抗體進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 CAV感染后PCR檢測結(jié)果 CAV感染后7 d,分別對各組隨機抽樣并進行 PCR檢測,結(jié)果CAV感染組(B)和CAV感染-Gt株免疫組(D)均出現(xiàn)650 bp特異性條帶,而Gx株攻毒對照組(A)和Gt株免疫組(C)均為陰性,表明B、D兩組在人工感染后7 d均在肝臟檢測到陽性信號,表明攻毒組有CAV的感染。

2.2 IBDV抗體檢測結(jié)果 對C、D兩組在14日齡、20日齡和28日齡采集的血清,用ELISA試劑盒對IBDV抗體進行檢測并計算結(jié)果。見表1、圖1。

表1 IBDV血清抗體檢測

結(jié)果表明:雞傳染性貧血病毒感染1日齡雛雞后導(dǎo)致免疫雞傳染性囊病活疫苗(Gt株)雛雞抗IBDV血清抗體滴度上升較Gt株免疫組緩慢。

2.3 Gx株攻毒結(jié)果 28日齡時用IBDV超強毒Gx株對所有試驗組攻毒,攻毒后連續(xù)觀察1周,直至雞無死亡為止,試驗結(jié)果如表2。

表2 Gx株攻毒結(jié)果

結(jié)果表明:在28日齡攻 IBDV超強毒Gx株后,CAV感染組(B組)死亡率最高為83.4%,Gt株免疫組(D組)無死亡,CAV感染-Gt株免疫組(D組)死亡率為10%,陰性對照組死亡率為73.4%。

3 分析與討論

自從崔現(xiàn)蘭等人[1]1992年首次報道該病以來,廣西、安徽、山東、河南、北京、河北、吉林等地也陸續(xù)報道了該病的流行。目前,該病在我國大部分地區(qū)存在并流行,由于CAV感染雛雞致死率低(一般為10%～15%)、臨床表現(xiàn)不明顯,常常被養(yǎng)殖人員所忽視有關(guān)。研究表明,CAV感染后可引起雛雞的免疫抑制導(dǎo)致雞群對某些疫苗的免疫效力下降或者增強弱毒疫苗的致病力,從而導(dǎo)致免疫失敗[2-4],給養(yǎng)禽業(yè)帶來間接經(jīng)濟損失。近年來我國雞IBD免疫失敗常有發(fā)生,CAV的感染可能是一個不可忽視的重要因素。本試驗通過CAV-M9905毒人工感染1日齡SPF雛雞,7日齡免疫雞傳染性囊病活疫苗(Gt株),同時在14、21日齡和28日齡時采集雛雞血清進行IBDV抗體效價檢測,結(jié)果表明:CAV的早期感染除能造成雛雞一定的死亡率外,還能造成耐過雞對雞傳染性囊病疫苗(Gt株)免疫效力低下,導(dǎo)致抗體滴度上升緩慢,疫苗保護率下降,因此在加強IBDV的防控同時應(yīng)加強CAV的監(jiān)測。

[1]崔現(xiàn)蘭,辜桂香.雞傳染性貧血病病毒的鑒定[J].中國畜禽傳染病,1992,6:3-5.

[2]De Herdt P,van den Bosch G,Ducatelle R,et al.Epidemiology and significance of chicken infectious anemia virus infections in broilers and broiler parents under nonvaccinated European circumstances[J].Avian Dis,2001,45:706-708.

[3]Otaki Y,Nunoya T,Tajima M,etal.Enhanced pathogenicity of chicken anemia agent by infectious bursal disease virus relative to the occurrence of Marek′s disease vaccination breaks[J].Nippon Juigaku Zasshi,1989,51:849-852.

[4]von Bulow V,Rudolph R,Fuchs B.Enhanced pathenogicity of chicken anemia agent(CAA)in dual infections with Marek′s disease virus(MDV),infectious bursal disease virus(IBDV)or reticuloendotheliosis virus(REV)[J].Zentralbl Veterinarmed B,1986,33:93-116.