黃宏,郭敏,徐祥,楊策,孫宏振,戴卉,馮帥南,王莎麗,張波

(1.第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所,創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室,重慶 400042;2.重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷燒傷科,重慶 400010;3.重慶醫(yī)科大學生理教研室,重慶 400016)

皮膚創(chuàng)傷修復(fù)/愈合是一個復(fù)雜而有序的過程。創(chuàng)傷部位釋放的多種細胞因子和生長因子嚴格調(diào)控創(chuàng)傷愈合過程,這些細胞因子在局部表達水平、表達類型以及表達規(guī)律決定了參與修復(fù)細胞的活性及功能狀態(tài),從而對組織修復(fù)速率、纖維化程度以及修復(fù)結(jié)局產(chǎn)生極其重要的影響[1]。基質(zhì)細胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)是一種由基質(zhì)細胞合成分泌、缺血缺氧誘導(dǎo)表達、對人類CD34+祖細胞等有顯著趨化作用的CXC類強效趨化因子[2,3],能與CXCR4特異性結(jié)合構(gòu)成SDF-1/CXCR4生物軸,參與并調(diào)節(jié)器官發(fā)生、干細胞歸巢、癌癥轉(zhuǎn)移和重要臟器損傷修復(fù)等病理生理過程[4-8]。皮膚損傷必然發(fā)生缺血缺氧,存在明顯誘導(dǎo)創(chuàng)面SDF-1表達的誘因,而大量文獻證實SDF-1是參與調(diào)節(jié)組織/器官損傷修復(fù)的關(guān)鍵細胞因子[9-11],由此我們推測,SDF-1可能參與皮膚創(chuàng)傷愈合過程,但是對其在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中的表達及作用了解甚少。為此,本實驗旨在探討SDF-1在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中的表達規(guī)律及其可能作用,為進一步豐富創(chuàng)面愈合的分子機制提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

一抗:SDF-1α抗體(購于美國Santa Cruz Biotechnology公司);RT-PCR試劑盒(購于 TaKaRa寶生物公司);二氨基聯(lián)苯胺(……DAB)、SP-9000通用免疫組化試劑盒(購于北京中衫金橋公司);SDF-1α及GAPDH 引物(由上海生工合成)。

1.2 實驗動物模型的建立

清潔級雄性昆明小鼠32只(第三軍醫(yī)大學實驗動物教研室提供),體重25-30 g.小鼠背部剃毛后,應(yīng)用速眠新Ⅱ(1 ml·kg-1)肌肉麻醉,常規(guī)消毒,于背部近頸側(cè)以脊柱為中線切除約1.5 cm ×1.5cm的正方形全層皮膚,創(chuàng)面以消毒紗布止血后暴露,不用任何藥物,常規(guī)飼養(yǎng),觀察傷口的自然愈合過程。分別于傷后第 1、2、3、4、5、7、10 和 14 天隨機取 4 只小鼠,麻醉后取材,切取創(chuàng)面組織。部分組織4%中性多聚甲醛緩沖固定液固定標本,常規(guī)脫水,包埋,切成5 μ m切片,用于組化染色。

同窩新生1 d和2周齡的昆明種小鼠各12只,清潔級,雌雄不拘。新生組小鼠于背部切除0.5 cm×0.5 cm的全層皮膚,創(chuàng)面以無菌紗布止血后暴露,母乳喂養(yǎng);2周齡小鼠用適量戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后,背部剃毛,常規(guī)消毒,于背部近頸部以脊柱為中線切除約1.0 cm×1.0 cm的全層皮膚,創(chuàng)面以消毒紗布止血后暴露,不用任何藥物,常規(guī)飼養(yǎng),于傷后1、2和3 d均隨機處死4只小鼠,切取創(chuàng)面及創(chuàng)緣正常側(cè)0.3 cm組織,切取正常小鼠皮膚組織作為對照組,所有標本液氮凍存,用RT-PCR法檢測SDF-1α基因表達。

1.3 小鼠皮膚成纖維細胞的分離培養(yǎng)

清潔級6-8周齡雄性昆明種小鼠,體重(28±2)g.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉,背部剃毛后常規(guī)消毒,取背側(cè)皮下組織。采用組織塊法分離培養(yǎng)小鼠皮膚成纖維細胞,分別用 0.1、1、10、100 ng/ml濃度的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白細胞介素1(interleukin 1,IL-1)作用于成纖維細胞,48 h后收獲細胞,對照組僅加培養(yǎng)基,不加任何刺激物。應(yīng)用RT-PCR法檢測細胞SDF-1α的基因表達。

1.4 免疫組化染色

取創(chuàng)面以及周圍0.5 cm寬的皮膚組織,室溫下4%中性多聚甲醛緩沖固定液固定標本48 h,逐級脫水,石蠟包埋,切成5 μ m 厚度切片。切片脫蠟至水化;經(jīng)0.3%過氧化氫-甲醇去除內(nèi)源性過氧化物酶,0.1%Tritox-100 37℃孵育 8 min;以 10%正常山羊血清封閉,滴加一抗SDF-1α(1∶300)4℃過夜;次日,PBS洗滌后,加入生物素化二抗和辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素分別在37℃孵育30 min,最后DAB顯色,蘇木素復(fù)染后,脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察,胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒的為陽性細胞。免疫組化陰性對照以PBS代替一抗。

1.5 RT-PCR檢測SDF-1α mRNA 表達

采用異硫氫酸胍一步法提取皮膚創(chuàng)面組織中的總RNA,紫外分光光度計測定RNA的濃度,凝膠電泳分析RNA結(jié)構(gòu)。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)對轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增,以三磷酸甘油醛脫氫酶(……,GAPDH)作為內(nèi)參對照,所用引物為:SDF-1α,上游引物:5'-AAA CTG TGC CCT TCA GAT TGT T-3',下游引物:5'-CGG GGA ACT AGT T TT TCC T TT T-3',產(chǎn)物大小為209堿基對(bp);GAPDH,上游引物:5'-TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA G-3',下游引物:5'-ATC CTG T TG CTG TAG CCG TAT T-3',產(chǎn)物大小470 bp.取 PCR反應(yīng)產(chǎn)物 10 μ l在1×TAE制備2.0%瓊脂糖凝膠中電泳,加入濃度為0.5 μ g/ml的溴化乙啶(……,EB)染色,用DL2000為標準來判斷PCR產(chǎn)物片段大小,恒壓5 V/cm電泳,然后用凝膠掃描儀觀察并掃描。實驗結(jié)果以檢測條帶與GAPDH條帶的總灰度值的比值作為檢測目的片段的相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學染色

正常皮膚組織表達力量SDF-1,主要表達在皮膚表皮基底層和真皮層成纖維細胞(圖1),正常皮膚表皮基底層細胞呈SDF-1陽性表達,而真皮間質(zhì)也可見少量陽性表達的細胞,主要是梭形的成纖維細胞。而創(chuàng)傷后第1天真皮組織內(nèi)SDF-1陽性細胞顯著增加,主要位于創(chuàng)緣表皮基底層、毛囊外周、血管上皮細胞以及間質(zhì)細胞胞漿內(nèi);傷后第3天,陽性表達細胞顯著減少,而血管周圍仍有一些SDF-1陽性細胞;傷后第5、7天,SDF-1陽性細胞又顯著增加,主要是位于真皮的基質(zhì)細胞、創(chuàng)沿表皮細胞、血管周圍和皮脂腺的一些細胞;傷后14天在真皮層成纖維細胞表達SDF-1,基底層未見有表達。

圖1 損傷前后SDF-1α在皮膚創(chuàng)面的表達(S-P,×400)Fig.1 Expression of SDF-1αat normal skin and wound skin after injury(S-P,×400)

表1 各組小鼠損傷后不同時間的SDF-1α的半定量結(jié)果(%,n=4)Tab.1 Semiquantitative analyses of SDF-1αgene amplification expressed by each group during initial stage of wound healing(%,n=4)

2.2 SDF-1 mRNA表達變化

正常皮膚組織存在SDF-1 mRNA表達,當皮膚組織發(fā)生缺損傷后1 d,SDF-1 mRNA表達較正常組織明顯增加(P＜0.01)。隨后,傷后2、3 d,SDF-1 mRNA表達減少,2 d時基本恢復(fù)到正常組織水平,3 d時表達量最低,低于正常組織水平(P＜0.05)。傷后4、5 d SDF-1 mRNA表達又開始回升(P＜0.01),5 d時達峰值(P＜0.01),以后又逐漸下降,14 d時基本恢復(fù)至正常水平。小鼠全層皮膚缺損傷創(chuàng)傷愈合過程中創(chuàng)面SDF-1 mRNA表達呈雙峰(圖 2)。

2.3 新生組和2周齡組創(chuàng)面愈合過程中SDF-1α基因的表達規(guī)律

新生組和2周齡組小鼠皮膚均構(gòu)成性表達SDF-1 mRNA。新生組的SDF-1 mRNA在創(chuàng)傷后表達呈逐漸增加趨勢,于第3天表達達峰值,顯著高于正常皮膚(P＜0.05);2周齡組的SDF-1 mRNA在創(chuàng)傷后第1天表達即增加,于第2天表達達峰值(P＜0.05),在第3天時表達雖減少,但仍高于正常皮膚(P＜0.05)。與2周齡小鼠比較,新生鼠傷后第2天SDF-1 mRNA表達顯著下降(P＜0.05),而第3天顯著升高(P＜0.05)(圖3,表1)。

2.4 不同濃度TNF-α和IL-1對成纖維細胞表達SDF-1α基因的影響

成纖維細胞構(gòu)成性表達SDF-1基因。低濃度(0.1 ng/ml)TNF-α和IL-1能夠顯著抑制成纖維細胞的SDF-1α基因表達(P＜0.05),并隨著濃度的增加,其抑制作用逐漸增強(圖4、5,表2),相同濃度的TNF-α組和IL-1組間差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

趨化因子是一類對細胞具有定向趨化、遷移和募集作用的細胞因子。機體組織發(fā)生創(chuàng)傷后,創(chuàng)面局部產(chǎn)生的趨化因子不僅能趨化白細胞以及修復(fù)細胞聚集到創(chuàng)面,而且還能激活這些細胞并增強它們的功能,因此,趨化因子在創(chuàng)傷修復(fù)中的作用十分重要。新近研究證實,SDF-1作為迄今發(fā)現(xiàn)的對骨髓細胞趨化效應(yīng)最強的趨化因子,在組織/器官損傷修復(fù)過程中發(fā)揮著極其重要的作用[2]。目前對SDF-1在重要臟器如心、腎等損傷修復(fù)過程中的作用研究報道較多,但其在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中的作用及機制尚不清楚[7,8]。為此,本實驗欲探討皮膚創(chuàng)傷后SDF-1在創(chuàng)傷愈合過程中的表達特點及其可能的作用。

圖2 RT-PCR檢測小鼠皮膚創(chuàng)傷后各時間點創(chuàng)面組織SDF-1 mRNA的表達Fig.2 Semiquantitative analyses of SDF-1 gene amplifications at different time after trauma by RT-PCR

SDF-1是以成纖維細胞和內(nèi)皮細胞為主的基質(zhì)細胞合成的趨化因子,并非由炎癥細胞分泌表達,在多種器官中持續(xù)性表達,SDF-1有6種同分異構(gòu)體:SDF-1、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε及 SDF-1φ,但它們在功能上沒有顯著差異,并且SDF-1α是其在體內(nèi)的主要存在形式[12],因此,本實驗主要觀察了SDF-1在創(chuàng)面的表達特征。本實驗結(jié)果顯示,正常皮膚組織構(gòu)成性表達SDF-1,主要表達于表皮基底層和真皮的成纖維細胞胞漿內(nèi)。在皮膚創(chuàng)傷愈合過程中,創(chuàng)緣SDF-1 mRNA表達呈雙峰改變,分別位于創(chuàng)傷后第1天和第5天。傷后第1天SDF-1 mRNA表達顯著增加,很可能與皮膚組織缺損造成的局部缺血缺氧有關(guān)。Daniel等[2]研究發(fā)現(xiàn),組織缺血缺氧能夠快速誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達,而后者能夠在轉(zhuǎn)錄水平上促進SDF-1表達上調(diào),SDF-1表達量與缺氧程度呈明顯的正相關(guān)。傷后第2、3天是創(chuàng)傷愈合炎癥反應(yīng)最為嚴重的階段,大量巨噬細胞募集創(chuàng)面,合成分泌大量促炎細胞因子,如IL-1和 TNF-α,通常在傷后第3天創(chuàng)面IL-1和 TNF-α表達達峰值[13]。有研究顯示,IL-1和 TNF-α能強烈抑制成纖維細胞合成和分泌SDF-1[14],由此可見,創(chuàng)面愈合的炎癥反應(yīng)期大量的炎癥細胞浸潤和炎癥細胞因子產(chǎn)生,可能對SDF-1 mRNA表達呈負性調(diào)控作用,因此,這可能是傷后第3天 SDF-1 mRNA表達顯著減少的重要原因。

圖3 皮膚創(chuàng)面愈合初期SDF-1和GAPDH的電泳結(jié)果Fig.3 Gel electrophoresis of SDF-1 and GAPDH during initial stage of wound healing

圖4 不同濃度TNF-α作用成纖維細胞后SDF-1和 GAPDH的電泳結(jié)果Fig.4 Gel electrophoresis of SDF-1 and GAPDH expressed by fibroblast after treated with different concentrations of TNF-α

圖5 不同濃度IL-1作用成纖維細胞后SDF-1和GAPDH的電泳結(jié)果Fig.5 Gel electrophoresis of SDF-1 and GAPDH expressed by fibroblast after treatment with different concentrations of IL-1

圖6 不同濃度TNF-α和IL-1作用成纖維細胞后SDF-1的RT-PCR結(jié)果Fig.6 RT-PCR analyses of SDF-1 expressed by fibroblast treated with different concentrations of TNF-αand IL-1

創(chuàng)傷后4-14 d進入創(chuàng)傷愈合的增殖期,此期可見明顯的肉芽組織形成,大量的新生血管形成使局部缺氧得以改善,同時可見大量增生的成纖維細胞。此時新生血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞構(gòu)成了肉芽組織的主要細胞成分,而它們均是SDF-1的重要來源細胞[2,14]。這可能是傷后第5天出現(xiàn)SDF-1表達再次達峰值的主要原因,隨后一直維持在較高水平。

本實驗還觀察了不同年齡小鼠皮膚創(chuàng)傷后SDF-1 mRNA的表達變化,結(jié)果顯示:不同年齡小鼠皮膚創(chuàng)面的SDF-1 mRNA表達規(guī)律不同,特別是在傷后前3天的炎癥反應(yīng)期,與成年小鼠完全不同,新生組和2周齡組小鼠皮膚SDF-1 mRNA表達水平是增加。以往研究認為,新生小鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟,炎癥細胞聚集功能不足,缺少炎癥介質(zhì),創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)(2-3 d)程度低[15,16],提示創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)程度可能對SDF-1 mRNA表達產(chǎn)生重要影響,新生鼠和2周齡組小鼠創(chuàng)面低炎癥反應(yīng)狀態(tài)可能是SDF-1 mRNA表達持續(xù)高水平的原因,進一步提示炎癥反應(yīng)對SDF-1 mRNA表達起著負調(diào)節(jié)作用。

成纖維細胞是創(chuàng)傷愈合和纖維化瘢痕形成的主要效應(yīng)細胞,不僅是損傷局部分泌的細胞因子和生長因子作用的主要靶細胞,也是一些細胞因子和SDF-1的重要來源。我們通過體外實驗觀察促炎細胞因子TNF-α和IL-1對于小鼠皮膚成纖維細胞SDF-1 mRNA表達的影響,結(jié)果顯示:炎性細胞因子能夠強烈抑制成纖維細胞SDF-1 mRNA表達,并且隨著細胞因子濃度的增加,其抑制作用顯著增強。本實驗結(jié)果與文獻報道是一致的[17]。

SDF-1是一個與新生血管生成以及促進干細胞募集密切相關(guān)的趨化因子[6,7],而炎性細胞因子對其表達具有負調(diào)控作用,炎癥反應(yīng)越重,SDF-1合成分泌越少,將嚴重影響創(chuàng)面愈合速度。這可能是感染創(chuàng)面愈合速度慢和愈合不良的重要原因之一。抑制創(chuàng)面炎癥反應(yīng),促進SDF-1合成分泌或外源性給予SDF-1治療,可能成為提高創(chuàng)面愈合速度、改善創(chuàng)面愈合質(zhì)量的新的治療手段,也暗示促炎細胞因子對于創(chuàng)面愈合與組織修復(fù)是不利的。

已有研究顯示SDF-1不僅是第一個報道的對人類CD34+祖細胞有強烈趨化作用的CXC趨化因子,也是參與新生血管形成的關(guān)鍵細胞因子[14,18]。有研究顯示,糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)面的SDF-1表達減少,循環(huán)中的內(nèi)皮祖細胞數(shù)目顯著減少,其增殖、黏附和形成血管的能力減弱,導(dǎo)致創(chuàng)面毛細血管密度顯著降低,即使增加外周循環(huán)的內(nèi)皮祖細胞數(shù)目,這些細胞也不能有效地到達到皮膚創(chuàng)面,但是增加創(chuàng)面的SDF-1表達,能顯著增加內(nèi)皮祖細胞募集到達創(chuàng)面,參與新血管形成,加速創(chuàng)面愈合,改善愈合質(zhì)量[19,20]。本研究結(jié)果提示,SDF-1參與了皮膚創(chuàng)傷愈合的炎癥期和增生期,其在創(chuàng)面的表達特征提示炎癥反應(yīng)(炎性細胞和炎性細胞因子)可能抑制SDF-1表達,其結(jié)果可能干擾創(chuàng)面新生血管形成,抑制骨髓來源的修復(fù)細胞在創(chuàng)面的募集,從而影響修復(fù)速度和愈合質(zhì)量,造成延遲愈合或愈合不良。因此,外源性SDF-1對創(chuàng)面愈合尤其是難愈創(chuàng)面可能具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

[1]Mescher A L,Neff AW.Regenerative capacity and the developing immune sy stem[J].Adv Biochem Eng Biotechnol,2005,93:39-66.

[2]Ceradini JD,Kulkarni AR,Callaghan MJ,et al.Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1[J].Nat Med,2004,10(8):858-864.

[3]Aiuti A,Webb IJ,Bleul C,et al.The chemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD34+hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to ex plain the mobilization of CD34+progenitors to peripheral blood[J].J Ex p Med,1997,185(1):111-120.

[4]Ratajczak MZ,Zuba-Surma E,Kucia M,et al.The pleiotropic effects of the SDF-1-CXCR4 axis in organogenesis,regeneration and tumorigenesis[J].Leukemia,2006,20(11):1915-1924.

[5]Kucia M,Reca R,Miekus K,et al.Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms:pivotal role of the SDF-1-CXCR4 axis[J].Stem Cells,2005,23(7):879-894.

[6]Jiang YP,Wu XH,Xing HY,et al.Role of CXCL12 in metastasis of human ovarian cancer[J].Chin Med J(Engl),2007,120(14):1251-1255.

[7]Tang YL,Qian K,Zhang YC,et al.M obilizing of haematopoietic stem cells to ischemic myocardium by plasmid mediated stromal-cell-derived factor-1α(SDF-1α)treatment[J].Regul Pept,2005,125(1-3):1-8.

[8]T? gel F,Isaac J,Hu Z,et al.Renal SDF-1 signals mobilization and homing of CXCR4 positive cells to the kidney after ischemic injury[J].Kidney Int,2005,67(5):1772-1784.

[9]Kucia M,Ratajczak J,Ratajczak MZ.Bone marrow as a source of circulating CXCR4+tissue-committed stem cells[J].Biol Cell,2005,97(2):133-146.

[10]Magda K,Ratajczak J,Reca R,et al.Tissue-specific muscle,neural and liver stem/progenitor cells reside in the bone marrow,respond to an SDF-1 gradient and are mobilized into peripheral blood during stress and tissue injury[J].Blood Cells Mol Dis,2004,32(1):52-57.

[11]Falanga V.Wound healing and its impairment in the diabetic foot[J].Lancet,2005,66(9498):1736-1743.

[12]林建銀,鄭志竑,章濤,等.分子醫(yī)學技術(shù)[M].北京:科學出版社,2000:49-51.

[13]Efron PA,Moldawer LL.Cy tokines and wound healing:the role of cytokine and anticy tokine therapy in the repair response[J].J Burn Care Rehabil,2004,25:149-160.

[14]Yu L,Cecil J,Peng SB,et al.Identification and expression of novel isoforms of human stromal cell-derived factor 1[J].Gene,2006,374:174-179.

[15]Adzick NS,Lorenz HP.Cells,matrix,growth factors and the surgeon:the biology of scarless wound repair[J].Ann Surg,1994,220(1):10-18.

[16]Olutoye OO,Yager DR,Cohen IK,et al.Lower cytokine release by fetal porcine platelets:a possible explaination for reduced inflammation after fetal wounding[J].J Pediatr Surg,1996,31(1):91-95.

[17]Fedyk ER,Jones D,Critchley HO,et al.Expression of stromal-derived factor-1 is decreased by IL-1 and TNF in dermal wound healing[J].J Immunol,2001,166(9):5749-5754.

[18]Gallagher KA,Liu ZJ,Xiao M,et al.Diabetic impairments in NO-mediated endothelial progenitorcell mobilization and homing are reversed by hyperoxia and SDF-1 alpha[J].J Clin Invest,2007,117(5):1249-1259.

[19]Gallagher KA,Liu ZJ,Xiao M,et al.Diabetic impairments in NO-mediated endothelial progenitorcell mobilization and homing are reversed by hyperoxia and SDF-1 alpha[J].J Clin Invest,2007,117(5):1249-1259.

[20]Stellos K,Langer H,Daub K,et al.Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+cells to endothelial progenitor cells[J].Circulation,2008,117(2):206-215.