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        創(chuàng)傷痛大鼠痛閾的晝夜節(jié)律實(shí)驗(yàn)研究

        2010-08-06 11:42:16薛紅牛蓓徐蕾余曙光唐勇吳巧鳳徐世珍王靜毛森
        關(guān)鍵詞:余弦截肢節(jié)律

        薛紅,牛蓓,徐蕾,余曙光,唐勇,吳巧鳳,徐世珍,王靜,毛森

        (1.成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 成都 610075;2.成都大學(xué)醫(yī)護(hù)學(xué)院,四川 成都 610016)

        疼痛是多種疾病的共同病理表現(xiàn),過強(qiáng)的疼痛或長期慢性的病理性疼痛,將引起機(jī)體產(chǎn)生一系列的生理病理改變。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明,在不同的時(shí)辰,機(jī)體對疼痛的反應(yīng)性的高低并不是恒定不變的。我們研究了創(chuàng)傷痛大鼠痛閾的晝夜節(jié)律變化,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

        1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1 實(shí)驗(yàn)動物

        選用SD大鼠(Sprague-Dawley rat,Inbred strain),清潔級合格動物,體重161.63 g±24.92 g,2月齡,雌雄各半,由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號:川實(shí)動管質(zhì)第9號)。

        所有動物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)10天,進(jìn)行痛閾篩選,其標(biāo)準(zhǔn)是:痛闡測定在5~15 s左右能引起甩尾反應(yīng)者用于實(shí)驗(yàn),凡痛閾值高于15 s或低于5 s者,表示動物反應(yīng)遲鈍或過敏,則不納入實(shí)驗(yàn)對象。本實(shí)驗(yàn)所有納入實(shí)驗(yàn)動物的平均痛閾為8.15 s±2.58 s.

        實(shí)驗(yàn)在成都中醫(yī)藥大學(xué)時(shí)間醫(yī)學(xué)測試室進(jìn)行,隔音、通風(fēng)、恒溫(22℃±1℃)、相對濕度 60%~65%、自動光-暗控制[LD12:12,即 08:00-20:00 光照(light,L),籠底光照強(qiáng)度300~400 Lux;20:00-08:00暗置(dark,D)]。所有動物均自由飲水?dāng)z食。馴養(yǎng)10天后用于實(shí)驗(yàn)。

        1.2 主要器械及儀器設(shè)備

        7360型疼痛甩尾痛閾測定儀(核定電壓220 V,頻率50 Hz,電流 1.25 A,UGO BASILE S.R.L,Biological Research Apparatus,意大利)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 動物分組及處理

        2.1.1 動物分組 實(shí)驗(yàn)開始前,將經(jīng)過痛閾篩選符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的96只大鼠分別稱重后,將痛閾和體重作為雙重選擇指標(biāo),利用SPSS 12.0軟件,將動物隨機(jī)分為12組,每組8只,雌雄各半。其中每 2組作為1個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),分別于6個(gè)相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)對不同組的動物進(jìn)行相應(yīng)處理。

        所有動物提供8 am-8 pm的人工光照,時(shí)間點(diǎn)分別為8am(ZT0,ZT即 zeitgeber time,為授時(shí)因子時(shí)間),12am(ZT4),4pm(ZT8),8pm(ZT12),12pm(ZT16),4am(ZT20)。

        每次實(shí)驗(yàn)時(shí)注意控制聲、光等因素的干擾。動物適應(yīng)性馴養(yǎng)10天后,于實(shí)驗(yàn)開始的第一天8~12點(diǎn)內(nèi)測定所有動物的痛閾作為基礎(chǔ)痛閾;第二天在以上6個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別對每16只大鼠進(jìn)行痛閾測定,測得值作為相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的術(shù)前痛閾;第三天進(jìn)行動物處理,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的4個(gè)組的動物的手術(shù)及痛閾測定(術(shù)后痛閾)均同時(shí)開始進(jìn)行。

        2.1.2 動物處理 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的2組動物分別作以下處理。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的動物在同一時(shí)間點(diǎn)同時(shí)開始進(jìn)行處理。

        空白對照組(簡稱空白組):不造模,于實(shí)驗(yàn)開始后與其他各組用同樣的方法、同樣的時(shí)間捆綁固定。動物總的固定時(shí)間為30 min.固定結(jié)束后立即測定痛閾。

        截肢模型組(簡稱截肢組):將大鼠固定于自制固定器上,固定10 min后行截肢手術(shù),手術(shù)結(jié)束后繼續(xù)固定動物,至總固定時(shí)間滿30 min.固定結(jié)束后立即測定痛閾,測定痛閾完畢將動物放回籠內(nèi)精心飼養(yǎng)。

        2.1.3 造模方法 參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行:消毒右后肢皮膚,在踝關(guān)節(jié)下約0.5 mm處截?cái)嘤液笾?縫合皮膚[1]。

        2.2 痛閾測定方法

        篩選動物時(shí),基礎(chǔ)痛閾測定在上午8-12點(diǎn)進(jìn)行。納入實(shí)驗(yàn)的動物,分別在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)1 h內(nèi)進(jìn)行痛閾測定。

        測定時(shí)均在同一室溫條件下,分別在6個(gè)時(shí)間(08:00 、12:00、16:00 、20:00、24:00、04:00)對處理前后的動物的痛閾進(jìn)行測定。測定痛閾時(shí)由固定人員測量動物甩尾反應(yīng)潛伏期,所有動物均以流水編號進(jìn)行痛閾測試。

        本實(shí)驗(yàn)采用輻射熱甩尾法測定痛閾[3],每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測試時(shí),所有動物按照流水號測定一次后,再按照流水號重復(fù)測定第二次、第三次,保證每只動物每次測試間隔均在10 min以上。取3次測定的平均值作為最后的痛閾。

        處理前后2次測定共得到兩個(gè)痛閾值,分別稱為術(shù)前痛閾和術(shù)后痛閾。以痛閾變化率作為衡量針刺抗創(chuàng)傷痛的效應(yīng)的指標(biāo)之一。痛閾變化率=(術(shù)后痛閾-術(shù)前痛閾)/術(shù)后痛閾×100%.

        2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行,另外,所有數(shù)據(jù)還采用Halberg余弦法進(jìn)行生物節(jié)律分析[4]。

        3 結(jié)果

        3.1 截肢手術(shù)前后大鼠痛閾的總體變化情況

        將95只納入實(shí)驗(yàn)的大鼠(馴養(yǎng)過程中1只大鼠死亡),分別于實(shí)驗(yàn)前、后分6個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定其在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的痛閾,計(jì)算其痛閾變化率。截肢、電針后,在相應(yīng)時(shí)間立即測定大鼠痛閾,結(jié)果見表1及圖1。

        表1 截肢手術(shù)前后不同時(shí)間點(diǎn)動物痛閾變化比較Tab.1 Changes of pain threshold in different time point before and after amputation

        表2 空白對照組截肢手術(shù)前后24小時(shí)動物痛閾節(jié)律變化比較Tab.2 Comparing of pain threshold circadian rhythm in different time point before and after amputation in blank group

        表3 截肢模型組截肢手術(shù)前后24小時(shí)動物痛閾節(jié)律變化比較Tab.3 Comparing of pain threshold circadian rhythm in different time pointbefore and after amputation in amputation group

        圖1 處理前24小時(shí)周期所有大鼠不同時(shí)間點(diǎn)全部大鼠痛閾變化的折線圖Fig.1 Turning curve of pain threshold in different time point before and after amputation(s)in all rats

        從表1和圖1可以看出,截肢前大鼠痛閾總體趨勢表現(xiàn)為白天高,夜間低,即痛閾最大值在白天12點(diǎn)-16點(diǎn),最小值在夜間 0點(diǎn)-4點(diǎn),除凌晨4:00和早晨8.00外,其余各組與24:00比較,均P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        應(yīng)用Halberg余弦軟件的單個(gè)余弦法程序,分別對動物術(shù)前不同時(shí)間點(diǎn)痛閾的數(shù)據(jù)進(jìn)行晝夜節(jié)律性分析,得出節(jié)律參數(shù),作為針刺前動物的痛閾晝夜節(jié)律數(shù)據(jù),結(jié)果顯示大鼠痛閾具有明顯的晝夜節(jié)律(F=123.685,P<0.001),中值±SE=7.846±0.116,振幅(95%CL)=3.793(2.681,4.271),峰相位(95%CL)=-184.389(-193.227,-172.586)(360度 =24小時(shí),0000=0度,故峰相位時(shí)間約12:30)。

        3.2 空白對照組大鼠實(shí)驗(yàn)處理前后痛閾的晝夜節(jié)律變化情況

        對截肢手術(shù)前后空白對照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的痛閾利用Halberg余弦軟件單個(gè)余弦法程序進(jìn)行余弦函數(shù)擬合,并分別計(jì)算其P值(P<0.05表示具有明顯的節(jié)律性)、中值、振幅及峰相位,結(jié)果顯示大鼠痛閾具有明顯的晝夜節(jié)律,如表2所示。由于空白對照組的痛閾變化率沒有明顯變化,所以不對其作節(jié)律分析。截肢手術(shù)前24小時(shí)周期全部大鼠痛閾的極坐標(biāo)圖和余弦曲線見圖2、圖3.

        從以上圖表可以看出,空白對照組大鼠痛閾在實(shí)驗(yàn)前后的24小時(shí)周期中具有明顯的晝夜節(jié)律,且與實(shí)驗(yàn)前的總體變化節(jié)律接近,均為白天痛閾高,夜間痛閾低,其中 16點(diǎn)時(shí)最高,0點(diǎn)(24點(diǎn))-4點(diǎn)最低。

        圖2 截肢手術(shù)前24小時(shí)周期全部大鼠痛閾的極坐標(biāo)圖和余弦曲線圖Fig.2 Cosine curve and turning curve of pain threshold in different time point 24h before amputation(s)in all rats

        圖3 空白對照組實(shí)驗(yàn)后24小時(shí)動物痛閾的極坐標(biāo)圖和余弦曲線圖Fig.3 Cosine curve and turning curve of pain threshold in different time point 24h after experiment in blank group

        3.3 截肢模型組大鼠截肢手術(shù)前后痛閾的晝夜節(jié)律變化情況

        對截肢手術(shù)前后截肢模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的痛閾利用Halberg余弦軟件單個(gè)余弦法程序進(jìn)行余弦函數(shù)擬合,結(jié)果見表3及圖4~圖6.創(chuàng)傷痛大鼠手術(shù)前痛閾節(jié)律與空白對照組類似。截肢模型組大鼠痛閾在實(shí)驗(yàn)前的24小時(shí)周期中具有明顯的晝夜節(jié)律,與實(shí)驗(yàn)前的總體變化節(jié)律接近,均為16點(diǎn)時(shí)最高,0點(diǎn)(24點(diǎn))~4點(diǎn)最低;實(shí)驗(yàn)后的痛閾和痛閾變化率均顯示出一定的晝夜節(jié)律,提示創(chuàng)傷痛大鼠的痛閾仍然具有晝夜節(jié)律,其痛閾變化率也表現(xiàn)出較弱的晝夜節(jié)律(P值為0.049,與0.05接近),說明各時(shí)間點(diǎn)痛閾變化并不相同,出現(xiàn)明顯的時(shí)辰差異。

        圖4 截肢模型組截肢手術(shù)前24小時(shí)動物痛閾的極坐標(biāo)圖和余弦曲線圖Fig.4 Cosine curve and turning curve of pain threshold in different time point 24h before amputation in amputation group

        圖5 截肢模型組截肢手術(shù)后24小時(shí)動物痛閾的極坐標(biāo)圖和余弦曲線圖Fig.5 Cosine curve and turning curve of pain threshold in different time point 24h after amputation in amputation group

        圖6 截肢模型組截肢手術(shù)后24小時(shí)動物痛閾變化率的極坐標(biāo)圖和余弦曲線圖Fig.6 Cosine curve and turning curve of circadian rhythm of pain threshold changing rate in different time point 24h after amputation in amputation group

        4 討論

        早在19世紀(jì),人類就已發(fā)現(xiàn)疼痛反應(yīng)具有晝夜節(jié)律性。大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明,在不同的時(shí)辰,機(jī)體對疼痛的反應(yīng)性的高低并不是恒定不變的。機(jī)體的痛閾具有明顯的以24 h為周期的晝夜節(jié)律,如Li G等對小鼠的痛閾研究顯示,夜間小鼠甩尾潛伏期更長(痛閾更高),且阿片受體拮抗劑納洛酮(10 mg/kg,i.p.)可降低痛閾[2];Koch HJ等研究了13例21-27歲健康受試者在 6點(diǎn)、12點(diǎn)、18點(diǎn)和24點(diǎn)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)對止血帶壓迫所致疼痛的耐受性,研究顯示,24點(diǎn)時(shí)對壓迫性疼痛的耐受性最高[3]。而且隨著疼痛、鎮(zhèn)痛的基礎(chǔ)和臨床研究的逐漸深入,其對免疫功能的影響也越來越受到人們的關(guān)注。手術(shù)、創(chuàng)傷等對機(jī)體造成免疫功能的抑制已研究很多,這種疼痛及創(chuàng)傷等應(yīng)激所造成的機(jī)體免疫抑制等效應(yīng),也具有明顯的晝夜節(jié)律特征[4]。時(shí)間生物學(xué)研究表明,人及動物對疼痛的敏感性均存在時(shí)間節(jié)律性,而許多鎮(zhèn)痛藥物及鎮(zhèn)痛手段的鎮(zhèn)痛效應(yīng)也具有時(shí)間節(jié)律性,如阿片類鎮(zhèn)痛劑夜間的鎮(zhèn)痛效應(yīng)明顯優(yōu)于白天[5]。我們的研究結(jié)果顯示,正常大鼠痛閾具有明顯的晝夜節(jié)律,其峰值在白天12點(diǎn)-16點(diǎn),谷值在夜間0點(diǎn)-凌晨4點(diǎn)左右,即明期痛閾較高,暗期痛閾較低;創(chuàng)傷痛大鼠痛閾明顯降低,尤其以早晨8點(diǎn)左右痛閾下降明顯,這可為臨床選擇手術(shù)時(shí)機(jī)等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        [1]黃彰海,孫文穎,劉昱,等.創(chuàng)傷大鼠下丘腦背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元放電變化及電針效應(yīng)[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,16(1):9-11.

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