孫新君,王正國,張波,朱佩芳,劉光軍,劉勇

(1.中國人民解放軍第89醫(yī)院全軍創(chuàng)傷骨科研究所 山東 濰坊 261045;2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所 重慶 400042)

MSCs是存在于骨髓環(huán)境中除造血干細(xì)胞外且有多向分化潛能的干細(xì)胞。因其取材方便、自體細(xì)胞移植不存在排斥反應(yīng)以及易于外源基因的導(dǎo)入和表達(dá),作為骨組織工程種子細(xì)胞的研究和應(yīng)用日益增多[1,2]。組織工程骨體內(nèi)修復(fù)的關(guān)鍵是種子細(xì)胞在體內(nèi)是否發(fā)揮作用,植入體內(nèi)后的結(jié)局如何等尚需要進(jìn)一步觀察。然而,要在體評價細(xì)胞與材料復(fù)合后的遷移、定位等十分困難,尤其是在局部微環(huán)境誘導(dǎo)分化后細(xì)胞與宿主骨髓源細(xì)胞或骨膜來源的骨形成細(xì)胞難以區(qū)分,從而難以正確評價MSCs的修復(fù)功能。本實驗利用綠色熒光蛋白小鼠MSCs進(jìn)行在體示蹤,從而觀測MSCs在骨形成局部的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 表達(dá)綠色熒光蛋白小鼠 5只(鼠齡4周),雌雄不限,體重約20±2 g,由昆明醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所提供;Balb/c裸鼠15只,雌雄不限,鼠齡5-6周,體重15-20 g,由中國科學(xué)院上海藥物研究所動物中心提供。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Percoll分離液(Pharmarcia),低糖DMEM 培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清(Hyclone產(chǎn)品),胰蛋白酶(Gibco)。

1.1.3 生物材料 選用豬松質(zhì)骨脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料,其制備方法參照文獻(xiàn)[3]。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的培養(yǎng) 由GFP小鼠股骨和脛骨抽出大約0.5 ml骨髓,用含10%FCS的DMEM 培養(yǎng)基稀釋成3 ml,將細(xì)胞懸液沿管壁緩慢加入含5ml Percoll(密度1.073×10-3g/L)的離心管中,DMEM培養(yǎng)基洗滌一次后,進(jìn)行梯度離心,2000 r/min離心20 min,小心吸取中間交界面的單核細(xì)胞層,加入完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FCS+青霉素100 U/ml-鏈霉素100 mg/L),將細(xì)胞以2×105cm2接種于25ml培養(yǎng)瓶。72h后首次換液去除未貼壁細(xì)胞,此后每3 d換液1次。大約12 d后細(xì)胞基本融合,應(yīng)用T rypsin-EDTA消化細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液后以1.0×104/cm2密度接種傳代。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞GFP表達(dá)。

1.2.2 細(xì)胞的種植 首先將大小2×2×2 mm的ACBM在DMEM 培養(yǎng)基中預(yù)濕,然后將1.0×106個MSC(第三代)制成100 ul細(xì)胞懸液,利用微量注射器加入基質(zhì)材料上,并盡量使細(xì)胞灌入孔隙中;在24孔板靜置培養(yǎng),37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)4 h后加入完全培養(yǎng)基覆蓋基質(zhì)材料,培養(yǎng)24 h.

1.2.3 模型制作方法 無菌條件下,以0.1 ml/kg(BW)的速眠新麻醉后,碘伏消毒,鋪巾,在髂后上棘處作5 mm長的切口,切開皮膚、筋膜,鈍性分離肌肉,制作肌袋模型,將單純 ACBM 和種植了MSCs的ACBM 分別植入裸鼠肌袋內(nèi)(15只,分別稱為實驗側(cè)和對照側(cè))逐層縫合切口。術(shù)后將裸鼠無菌環(huán)境下分籠飼養(yǎng),定期觀察、檢測。1.2.4 檢測方法

細(xì)胞粘附:于MSCs種植于材料后6 h、24 h,隨機(jī)抽取4個標(biāo)本,倒置顯微鏡下觀察MSC附著及生長;培養(yǎng)24 h后將材料用戊二醛固定后剖開,取中央部分制作掃描電境標(biāo)本,觀察種植后細(xì)胞在材料內(nèi)表面粘附伸展。

大體觀察:術(shù)后裸鼠的飲食、活動及傷口情況,4-12周植入材料取出時的大體觀察。

X線及組織學(xué):分別于材料植入后4、8、12周隨機(jī)抽取5只動物進(jìn)行X平片檢查,然后將植入材料及毗鄰組織取出后,制作冰凍切片直接在熒光顯微鏡下觀察種植MSCs的定位及GFP的表達(dá);同時將相連續(xù)的層面制作石蠟切片,行HE染色,觀察新骨形成情況。

2 結(jié)果

2.1 MSCs的分離、培養(yǎng)及粘附

原代細(xì)胞主要以克隆集落方式生長,細(xì)胞基本上為紡錘形的成纖維細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞傳代后,呈均勻分布的紡錘形細(xì)胞生長。熒光顯微鏡下觀察,原代及傳代MSCs均表達(dá)GFP。MSCs種植于材料后6 h,倒置顯微鏡下可見材料表面MSCs開始伸展(圖1a);隨后,細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時間延長逐漸增多;SEM觀察見種植后6 h,細(xì)胞在材料內(nèi)表面粘附伸展;培養(yǎng)24 h,細(xì)胞間出現(xiàn)連接(圖1b)。

2.2 大體觀察

術(shù)后動物存活良好,未見植骨處紅腫、滲液及感染,切口2 w愈合。裸鼠體內(nèi)GFP小鼠MSCs-材料植入后8 w,皮下可觸及質(zhì)硬的包塊;12 w,形成明顯的皮下結(jié)節(jié),裸鼠植入松質(zhì)骨側(cè)4w,X線照片顯示植入材料部分吸收;12周,松質(zhì)骨材料被吸收,X線平片觀察,與周圍組織無明顯差別。而GFP鼠MSCs-復(fù)合材料植入側(cè),4-12 w,局部骨痂密度逐漸加強(qiáng),面積逐漸變大(圖2a)。解剖見實驗側(cè)新生骨組織成團(tuán)塊狀凸出至皮下,周圍有豐富的血管(圖2b)。

2.3 組織學(xué)觀察

HE染色可見實驗側(cè)以移植物為中心有大量軟骨以及少量新骨生成,材料逐漸降解,并有血管、肌肉、纖維組織長入材料間隙中,未發(fā)現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng);在移植物中央新骨形成較少,髓腔內(nèi)有小梁骨形成。

植入GFP小鼠MSCs-材料復(fù)合物側(cè),4w時熒光顯微鏡下見局部有較強(qiáng)的熒光物質(zhì)聚集,結(jié)合HE染色判斷,熒光物質(zhì)主要集中在新生軟骨基質(zhì)中;8-12w,標(biāo)記有綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量明顯減少,而熒光物質(zhì)主要沉積在新生骨基質(zhì)中,12w時,熒光顯微鏡下仍有較強(qiáng)的亮度(圖3)。

圖1 細(xì)胞種植后粘附與生長Fig.1 Adhension and proliferation of MSCs on ACBM

3 討論

細(xì)胞與材料的相互作用是組織工程研究的重要領(lǐng)域,其中細(xì)胞與材料的粘附是體外構(gòu)建組織工程骨的前提和基礎(chǔ)[4],細(xì)胞必須與材料發(fā)生適當(dāng)?shù)恼掣?才能進(jìn)行遷移、增殖、分化及生物學(xué)活性的表達(dá)[5]。無論在體外,還是體內(nèi),直接也是最先與組織細(xì)胞相接觸并發(fā)生作用的是材料表面,因此細(xì)胞與材料表面的粘附相當(dāng)重要,而且還將影響細(xì)胞的增殖、分化等一系列反應(yīng)[6]。

圖2 MSCs-材料植入后 12w,裸鼠體內(nèi)成骨Fig.2 Osteogenesis in nude mouse at 12 weeks after implantation of MSCs seeded ACBM

圖3 材料復(fù)合物側(cè),植入4-12w成骨觀察Fig.3 Histology of the new formed bone at 4-12 weeks of cell-scaffold implantation

研究表明,MSCs表面的整合素受體可與RGD(精-甘-天冬氨酸)、人工合成的短肽如 GRGDS(甘-精-甘-天冬-絲)或者 RGDS(精-甘-天冬-絲氨酸)等配體結(jié)構(gòu)結(jié)合,從而使包含或復(fù)合這些小分子結(jié)構(gòu)的材料增強(qiáng)對種子細(xì)胞的粘附,因此,該類物質(zhì)在組織工程材料中有廣泛應(yīng)用[7,8]。在天然骨組織中,大多數(shù)骨基質(zhì)蛋白如纖維連接蛋白、骨橋蛋白、I型膠原、骨涎蛋白等具有促進(jìn)細(xì)胞粘附的RGD序列,后者可以特異性結(jié)合細(xì)胞膜整合素受體[8],從而促進(jìn)細(xì)胞與材料的粘附及分化。

掃描電鏡結(jié)果顯示本實驗使用的ACBM不但有良好的網(wǎng)孔和表面結(jié)構(gòu),其膠原纖維在制備過程中也有良好的暴露;有利于其中的 RGD結(jié)構(gòu)與MSCs的粘附[9]。

MSCs在體外具有大量擴(kuò)增能力,可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞,能滿足體內(nèi)組織工程骨對種子細(xì)胞‘質(zhì)和量'的要求,而且初步的臨床研究表明修復(fù)非承重部位骨缺損效果良好[2];組織工程骨體內(nèi)修復(fù)的關(guān)鍵是種子細(xì)胞在體內(nèi)是否發(fā)揮作用,因此,本實驗采用近年來在組織工程及組織修復(fù)中作為示蹤細(xì)胞得到廣泛的應(yīng)用,轉(zhuǎn)染GFP基因,能夠傳代并穩(wěn)定表達(dá)GFP小鼠MSCs與材料復(fù)合構(gòu)建組織工程骨[10,11],植入裸鼠體內(nèi),觀察細(xì)胞-材料復(fù)合后種子細(xì)胞在體內(nèi)的結(jié)局。

組織學(xué)觀察顯示:實驗側(cè)移植物周圍及中央部均有大量新骨形成,而且通過軟骨內(nèi)骨化成骨;而對照側(cè)見ACBM逐漸吸收。熒光顯微鏡下,4周時GFP主要表達(dá)于細(xì)胞內(nèi),隨后新生軟骨及骨基質(zhì)中均有GFP的沉積,此后隨修復(fù)時間延長,骨基質(zhì)中GFP的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。但在骨組織中殘存部分細(xì)胞仍見較強(qiáng)的熒光。由此可見,表達(dá)GFP的MSCs與ACBM復(fù)合后在受體內(nèi)能夠存活并且發(fā)揮成骨效應(yīng)。

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