游華,矯樹生,陳建梅,李兵倉

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第六研究室,創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400042;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院淋巴瘤及頭頸部腫瘤科,北京100071;3.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院骨科,福州350025)

組織工程人工神經(jīng)的應(yīng)用極大的提高了神經(jīng)缺損的修復(fù)效果,先前的研究已經(jīng)初步闡明了構(gòu)建的組織工程人工神經(jīng)OEC-SC-ECM-PLGA橋接體對大鼠坐骨神經(jīng)缺損的解剖學(xué)修復(fù)作用[1],及對外周靶器官與脊髓神經(jīng)元的保護(hù)作用[2]。本文將探討OEC-SC-ECM-PLGA橋接體對大鼠坐骨神經(jīng)缺損后神經(jīng)再生速度的影響。

1 材料與方法

1.1 OEC和SC的分離培養(yǎng)及鑒定、PLGA導(dǎo)管的制作、OEC和SC的預(yù)標(biāo)記,動(dòng)物的類型(品系)、數(shù)量及來源,動(dòng)物模型的建立及分組,按文獻(xiàn)[1-3]介紹的方法進(jìn)行。

1.2 神經(jīng)再生速度的測定

術(shù)后1,3,6,9周,30 g/L戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后,取材橋接管內(nèi)再生組織,冰凍縱行切片,片厚10 μ m,PBS漂洗3次×5 min,封閉山羊血清室溫下孵育 20 min,加入小鼠抗大鼠NF200單克隆抗體(Sigma,1∶1000)一抗工作液,37℃孵育3h,PBS漂洗3次×5 min,加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(Molecular Probe,1∶50)二抗工作液37℃孵育30min,PBS漂洗3次×5 min,熒光顯微鏡FITC模式下測量橋接體內(nèi)NF200標(biāo)記的再生神經(jīng)纖維向遠(yuǎn)端橋接點(diǎn)方向所能到達(dá)的最遠(yuǎn)距離,再根據(jù)時(shí)間計(jì)算出神經(jīng)纖維的再生速度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

根據(jù)神經(jīng)微絲(neurofilament,NF)對神經(jīng)纖維的顯示性,利用免疫組化的方法,在熒光顯微鏡下測定再生神經(jīng)微絲所能到達(dá)的最遠(yuǎn)距離,即神經(jīng)纖維所能到達(dá)的最遠(yuǎn)距離,再根據(jù)時(shí)間計(jì)算神經(jīng)纖維再生速度。術(shù)后1、3、6 w,NF200免疫組化染色不能著色,因而神經(jīng)再生速度無法計(jì)算,這可能和再生的神經(jīng)纖維較為幼稚有關(guān)。術(shù)后9w,OEC-SC-ECMPLGA組和自體神經(jīng)移植組神經(jīng)纖維到達(dá)的最遠(yuǎn)距離為(15.00±0.00)mm,顯著遠(yuǎn)于OEC-ECMPLGA組的(12.60±1.14)mm和SC-ECM-PLGA組的(12.60±1.95)mm(P＜0.05),這些數(shù)據(jù)被時(shí)間21d除,得到OEC-SC-ECM-PLGA組和自體神經(jīng)移植組的神經(jīng)再生速度均為(0.71±0.00)mm/d,顯著快于OEC-ECM-PLGA組的(0.60±0.05)mm/d,SC-ECM-PLGA組(0.60±0.09)mm/d(P＜0.05)。由于ECM-PLGA組和PLGA組去除神經(jīng)支架后近端可見細(xì)小錐狀突起,經(jīng)HE染色證實(shí)無神經(jīng)組織成分,故其神經(jīng)再生速度均為零。

圖1 術(shù)后9w自體神經(jīng)移植組NF200免疫組化染色結(jié)果Fig.1 NF200 immunohistochemisty in nerve autograft group 9 weeks

3 討論

人工神經(jīng)對神經(jīng)再生的誘導(dǎo)、促進(jìn)和規(guī)范作用正是通過種子細(xì)胞自身或其分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子而實(shí)現(xiàn)的,因而種子細(xì)胞是人工神經(jīng)的核心部份。從可查閱到的文獻(xiàn)來看,以往應(yīng)用的種子細(xì)胞有SC、OEC、骨髓基質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞等。近來研究發(fā)現(xiàn),成年哺乳動(dòng)物的嗅神經(jīng)系統(tǒng)是極少數(shù)可以再生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)之一,其再生能力與嗅球的一種膠質(zhì)細(xì)胞 —OEC密切相關(guān)。OEC是一類介于SC和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的特殊類型的膠質(zhì)細(xì)胞,主要分布在嗅球的嗅神經(jīng)層和顆粒層),能支持嗅神經(jīng)的終生存活和再生。在嗅神經(jīng)的再生過程中OEC不僅可誘導(dǎo)再生神經(jīng)纖維長入中樞的嗅球,也對其具有機(jī)械保護(hù)作用,而且可表達(dá)各種神經(jīng)營養(yǎng)因子等神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì),也能合成L1和神經(jīng)細(xì)胞粘附分子等有益于軸突再生的物質(zhì),同時(shí)分泌層粘連蛋白、纖維連接蛋白、IV型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)成分。這些物質(zhì)無疑為OEC修復(fù)周圍神經(jīng)缺損提供了良好條件。OEC的神經(jīng)再生修復(fù)作用可概括為髓鞘再形成、重建朗飛氏結(jié)、促軸突再生、增強(qiáng)可塑性、募集內(nèi)源性雪旺細(xì)胞、遠(yuǎn)距離抑制皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡等[4]。更令人振奮的是,OEC能夠減少硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPG)的分泌以及穿越膠質(zhì)瘢痕而發(fā)揮修復(fù)作用[5]。

SC是周圍神經(jīng)的成髓鞘細(xì)胞,被最早用于構(gòu)建人工神經(jīng),在外周神經(jīng)修復(fù)中具有舉足輕重的作用[6]。鑒于OEC和SC的這些特性,我們研究發(fā)現(xiàn)OEC和SC兩種種子細(xì)胞聯(lián)合的人工神經(jīng)修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損的效果優(yōu)于單細(xì)胞移植,但其中任何一種細(xì)胞移植的修復(fù)效果都比無細(xì)胞移植組好[1,2]。而神經(jīng)再生速度可以定量地觀察移植細(xì)胞的促神經(jīng)再生效果,從另一個(gè)側(cè)面印證了我們先前的結(jié)果,術(shù)后9w,OEC和SC聯(lián)合應(yīng)用其神經(jīng)再生速度可以達(dá)到自體神經(jīng)移植一樣的效果,顯著快于單獨(dú)應(yīng)用,但任何一種細(xì)胞的應(yīng)用其神經(jīng)再生速度顯著快于無細(xì)胞移植,這可能和OEC和SC促神經(jīng)再生的協(xié)同作用有關(guān)[1]。

[1]游華,矯樹生,馮帥南,等.OEC-SC-ECM-PLGA橋接體對大鼠坐骨神經(jīng)缺損的解剖學(xué)修復(fù)作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(21):2015-2019.

[2]游華,矯樹生,馮帥南,等.大鼠坐骨神經(jīng)缺損后組織工程人工神經(jīng)對外周靶器官及脊髓神經(jīng)元的保護(hù)作用[J].中華創(chuàng)傷雜志,2010,26(3):265-269.

[3]游華,矯樹生,陳建梅,等.嗅球成鞘細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,8(1):10-12.

[4]Dombrowski MA,Sasaki M,Lankford KL,et al.Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells[J].Brain Res,2006,1125(1):1-8.

[5]Lindsay SL,Riddell JS,Barnett SC.Olfactory mucosa for transplant-mediated repair:a complex tissue for a complex injury[J].Glia,2010,58(2):125-134.

[6]矯樹生,李兵倉.周圍神經(jīng)組織工程中種子細(xì)胞的最新研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志,2007,6(5):528-530.