陳莉發(fā),段朝霞,張潔元,李兵倉,余華榮

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室,重慶 400016;2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第六研究室,創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室,重慶 400042)

嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是一種特殊的膠質(zhì)細(xì)胞,能促進嗅神經(jīng)再生,引導(dǎo)無髓鞘嗅神經(jīng)軸突從外周嗅粘膜上皮出發(fā),穿過篩板,進入嗅球,使嗅神經(jīng)終身具有再生性[1]。OECs分泌許多神經(jīng)營養(yǎng)因子[2,3],如神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF),神經(jīng)營養(yǎng)因-4/5(neurotrophin-4/5,NT-4/5)和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuregulin,NRG)。OECs獨特的生物學(xué)特性引起了眾多學(xué)者的興趣,目前,對OECs移植修復(fù)作用的研究頗多,但對其移植后存活的研究報道較少,或者結(jié)論不統(tǒng)一。本研究以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)轉(zhuǎn)基因大鼠為供體,觀察其嗅球OECs植入挫傷脊髓后的存活情況,從而為其在移植修復(fù)中的作用提供細(xì)胞學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 2.5月齡清潔級GFP轉(zhuǎn)基因大鼠,體重(220±15)g.2.5月齡清潔級普通SD大鼠,體重(220±15)g(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供)。所有動物的飼養(yǎng)和處理均按第三軍醫(yī)大學(xué)動物管理委員會的規(guī)定進行。

1.1.2 主要儀器設(shè)備、試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO,美國);胎牛血清(FCS,GIBCO,美國);Forskolin(INVITROGEN,美國);堿性成纖維生長因子(bFGF,INVITROGEN,美國);多聚左旋賴氨酸(poly-l-lysine,SIGMA,美國);胰蛋白酶(GIBCO,美國);小鼠抗大鼠S100蛋白抗體(S100,武漢博士德);兔抗神經(jīng)生長因子受體多克隆抗體(NGFR p75,武漢博士德);TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(武漢博士德);FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(武漢博士德);Hoechst33342(SIGM A,美國)。NYU撞擊機(美國);立體定位儀(ST-7,日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 OECs的原代培養(yǎng) 3%戊巴比妥鈉致死劑量(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,斷頭,消毒后無菌環(huán)境下迅速取出GFP轉(zhuǎn)基因大鼠雙側(cè)完整嗅球。剪去嗅球尾側(cè)1/3,取頭側(cè)2/3置于4℃預(yù)冷的D-Hanks液中(青、鏈霉素各100 U/L)。用顯微外科器械在解剖顯微鏡下仔細(xì)剝除包被嗅球的軟腦膜及附著的毛細(xì)血管,沿縱軸方向剖開嗅球,剝除嗅球內(nèi)部的白質(zhì)層,將分離得到的外部灰質(zhì)層,即嗅球纖維層和嗅小球?qū)?用眼科彎剪剪碎至1 mm大小組織塊,0.125%胰蛋白酶37℃消化20 min.巴氏滴管小心吸取消化后的組織塊,移至加有3 ml DFF20(DMEM/F12/20%FCS)全培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中終止消化,5 min后,移至加有3 ml DFF20全培養(yǎng)液的離心管內(nèi),用經(jīng)火焰拋光的巴氏滴管吹打15-20次,使組織塊分散成單細(xì)胞懸液,靜置5 min后收集上層細(xì)胞懸液。接種于包被多聚左旋賴氨酸(10 μ g/ml)的 6孔培養(yǎng)板內(nèi),置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后,用添加有Forskolin(100 mg/l)和bFGF(0.01 mg/l)的DFF20全培養(yǎng)液半量換液一次,以后每2-3天全量換液 1次。培養(yǎng)第10天,植入損傷脊髓。

1.2.2 GFP-OECs移植

制備GFP-OECs懸液:用酶消化法將培養(yǎng)10 d的 GFPOECs制成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度為 3×105個/μ l.

建立脊髓T10挫傷模型:取SD大鼠,3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于手術(shù)臺,備皮,碘伏消毒皮膚,酒精脫碘,鋪無菌巾,無菌條件下暴露脊髓T10節(jié)段,置于NYU撞擊機固定,以10g、25mm致傷力挫傷脊髓。

移植GFP-OECs:將脊髓挫傷后的SD大鼠置于立體定位儀固定,用玻璃微電極吸取細(xì)胞懸液,注入損傷部位及其首尾側(cè)各 1 mm 處,每處注射 1 μ l,共計 3 μ l,注射深度 1 mm,留針 1 min,隨后縫合肌肉、皮膚各層,移植術(shù)后將動物分為兩組:環(huán)孢菌素A組,移植術(shù)后每天腹腔注射環(huán)孢菌素A(cyclosporin,CsA)(10 mg/kg);非環(huán)孢菌素A組,術(shù)后未注射環(huán)孢菌素A.動物術(shù)后均與揉壓排尿和抗感染護理,兩組動物于移植術(shù)后1、2、4、8周麻醉后開胸暴露心臟,經(jīng)主動脈灌注生理鹽水200 ml,4%多聚甲醛400 ml,取出移植部位脊髓置相同固定液繼續(xù)固定2 h,制作15μ m厚冰凍切片,于熒光倒置顯微鏡下觀察GFP-OECs.

2 結(jié)果

2.1 非環(huán)孢菌素A組

此組動物移植術(shù)后 1、2周取材,制成冰凍切片,于熒光顯微鏡下?lián)p傷的脊髓處可見自發(fā)綠色熒光的OECs(圖1A、B),移植術(shù)后4周,損傷的脊髓處未見綠色的OECs(圖1C)。

2.2 環(huán)孢菌素A組

此組動物移植術(shù)后1周、2周、4周取材,制成冰凍切片,于熒光顯微鏡下?lián)p傷的脊髓處可見自發(fā)綠色熒光的OECs(圖2A-C),移植術(shù)后8周,損傷的脊髓處未見綠色的OECs(圖2D)。

3 討論

GFP作為標(biāo)記物,被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞移植的研究領(lǐng)域,GFP轉(zhuǎn)基因動物分離得到的細(xì)胞標(biāo)記穩(wěn)定,且不影響或很少影響細(xì)胞的正常功能,是細(xì)胞移植研究最為理想的工具[4]。本實驗從GFP轉(zhuǎn)基因動物分離得到自發(fā)綠色熒光的嗅鞘細(xì)胞,存活的嗅鞘細(xì)胞在藍(lán)色熒光下呈肉眼可見的綠色,具有觀察簡單、避免假陽性等優(yōu)點。

移植物存活時間一方面取決于移植物本身,另一方面取決于移植排斥反應(yīng)的強弱。引起移植排斥反應(yīng)的抗原稱為移植抗原或組織相容性抗原,能引起強烈排斥反應(yīng)的抗原稱為主要組織相容性抗原(MHC抗原),供、受者間M HC型別差異是發(fā)生急性排斥反應(yīng)的主要原因[5]。OECs高表達M HC-Ⅰ分子,中等表達MHC-Ⅱ分子[6],M HC分子與抗原肽形成抗原肽/MHC分子復(fù)合物供T細(xì)胞識別,活化的T細(xì)胞可直接殺傷表達異型抗原的移植物細(xì)胞,環(huán)孢菌素A是一種不溶性的真菌代謝產(chǎn)物,含有11個氨基酸的環(huán)狀多肽,能有效地抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng),使T細(xì)胞的擴增和分化受阻,環(huán)孢菌素A是一種抗有絲分裂和抗炎雙重效應(yīng)的高效免疫抑制劑。急性排斥反應(yīng)一般在移植術(shù)后數(shù)天至2周左右出現(xiàn),本實驗未注射環(huán)孢菌素A組細(xì)胞存活時間只有2周,注射環(huán)孢菌素A組細(xì)胞移植后4周仍存活,說明OECs移植到脊髓存在排斥反應(yīng),而細(xì)胞移植后8周,未見綠色熒光的 OECs,說明 GFP-OECs死亡,不能表達綠色熒光蛋白。因此,OECs存活時間大于4周但小于8周,OECs移植后不能長期存活,避免給機體帶來不良后果,比如“異位”占位,腫瘤等。

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