魏冬霞，鄧 艷，吳紹強(qiáng)，林瑞慶，宋慧群，朱興全

(1.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇泰州225300；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；3.廣州機(jī)場(chǎng)出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510470；4.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100029)

豬蛔蟲病是由蛔科(Ascaridae)的豬蛔蟲(Ascaris suum)寄生于豬小腸引起的一種線蟲病。該病不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，而且由于豬蛔蟲感染性幼蟲還會(huì)引起人的眼幼蟲移行癥和內(nèi)臟幼蟲移行癥，對(duì)人類健康構(gòu)成危害[1-2]。由于豬蛔蟲產(chǎn)卵量大，蟲卵對(duì)外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)等因素，從而造成豬蛔蟲病的廣泛流行。卵黃蛋白原(VIT)為雌性腸道上皮細(xì)胞合成的一種具有脂類結(jié)合能力的蛋白質(zhì)，它可以通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入卵巢中的胚胎內(nèi)，為后代的發(fā)育提供能量。如能選擇性地抑制或阻斷豬蛔蟲雌蟲VIT基因的表達(dá)，則可抑制成蟲的繁殖及產(chǎn)卵，從而有效地控制豬蛔蟲病的傳播和流行。本研究以豬蛔蟲雌蟲VIT基因的EST序列為模板設(shè)計(jì)引物，對(duì)豬蛔蟲雌蟲cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，并獲得了豬蛔蟲VIT基因序列，為該基因的深入研究奠定基礎(chǔ)。

目前用于文庫(kù)篩選的方法很多，傳統(tǒng)的文庫(kù)篩選方法包括原位雜交篩選、抗體篩選和功能表達(dá)篩選。這些方法的缺點(diǎn)是消耗材料多，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而以PCR為基礎(chǔ)的篩選文庫(kù)方法具有許多優(yōu)勢(shì)[3-5]。本研究利用PCR法和排除法相結(jié)合的96孔板-PCR排除法對(duì)豬蛔蟲雌蟲的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得了豬蛔蟲雌蟲VIT基因序列。

1 材料和方法

1.1 cDNA擴(kuò)增文庫(kù)和陽(yáng)性對(duì)照菌 豬蛔蟲雌蟲cDNA文庫(kù)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲學(xué)研究室構(gòu)建[6]，文庫(kù)擴(kuò)增后滴度達(dá)3×109cfu/mL，插入片段在0.7 kb～2 kb之間，平均插入片段長(zhǎng)度1.2 kb，每孔原始克隆數(shù)約為1800個(gè)；陽(yáng)性對(duì)照重組菌F993(試驗(yàn)編號(hào))系經(jīng)抑制消減雜交方法篩選出的豬蛔蟲雌蟲差異表達(dá)的cDNA插入pGEM-T載體(Promega)中，轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞[7]，該重組菌株由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.2 主要試劑和引物 DL-2000 DNA Marker和TaqDNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

根據(jù)重組菌株F993的EST序列設(shè)計(jì)引物，其序列為：F993UP：5'-ACGACGAGGAGTGCGAC AT-3'； F993DOWN： 5'-GTAGAGCGAGGCAGACA AG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為274 bp。由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.3 PCR反應(yīng)條件 PCR擴(kuò)增條件：94℃5 min；94℃30 s、55℃30 s、72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5 min。

1.4 cDNA文庫(kù)的初步篩選 分別取1 μL保存于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的擴(kuò)增文庫(kù)在96孔PCR反應(yīng)板中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(克隆F993的菌液)和空白對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 cDNA文庫(kù)分部排除篩選

1.5.1 分板排除非陽(yáng)性克隆 取含有陽(yáng)性克隆的擴(kuò)增文庫(kù)10 μL，用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別取1 μL稀釋液進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定可檢測(cè)到陽(yáng)性條帶的最大稀釋倍數(shù)。然后取1 μL含陽(yáng)性克隆的最大稀釋倍數(shù)的稀釋液(即可檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)的最大稀釋倍數(shù)的下級(jí)稀釋液50 μL)鋪含有氯霉素的LB培養(yǎng)板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。平板上的菌落分別用LB液體培養(yǎng)液洗脫菌落，并對(duì)收集的菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定含陽(yáng)性克隆的洗液。

1.5.2 分區(qū)排除非陽(yáng)性克隆 將含陽(yáng)性克隆的洗液按上述方法進(jìn)行稀釋，PCR檢測(cè)和鋪板培養(yǎng)。收菌時(shí)每板分4～6區(qū)收取單菌落。如此經(jīng)幾輪篩選，直到能確保在100個(gè)以下的克隆里含有1個(gè)陽(yáng)性克隆為止。

1.6 陽(yáng)性克隆的鑒定 直接挑取經(jīng)篩選后的克隆進(jìn)行PCR鑒定；或者將每板上的菌落按每10個(gè)～20個(gè)克隆分區(qū)，每區(qū)的克隆挑在同1個(gè)培養(yǎng)管中，37℃，170 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌液PCR確定含陽(yáng)性克隆的區(qū)，最后再挑取原板中陽(yáng)性區(qū)的單克隆到800 μL LB液體培養(yǎng)基中，加入氯霉素后37℃過(guò)夜培養(yǎng)。分別取1 μL單克隆菌液做模板進(jìn)行PCR，鑒定出陽(yáng)性克隆。最后鑒定陽(yáng)性克隆插入片段的大小。將檢測(cè)到的克隆菌液進(jìn)行擴(kuò)繁與鑒定后測(cè)序，并對(duì)該序列進(jìn)行初步分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 cDNA文庫(kù)的初步篩選結(jié)果 初步篩選擴(kuò)增文庫(kù)(保持于96孔板上)，結(jié)果見(jiàn)圖1。選取陽(yáng)性信號(hào)較強(qiáng)的孔G10做下一步篩選。結(jié)果顯示，幾乎所有的孔均為陽(yáng)性，表明該基因是高豐度基因，這與吳紹強(qiáng)等從豬蛔蟲雌蟲和雄蟲的抑制消減文庫(kù)中挑出的隨機(jī)克隆測(cè)序結(jié)果相符[7]，表明該基因在豬蛔蟲雌蟲中呈高表達(dá)狀態(tài)。

2.2 分部排除篩選cDNA文庫(kù)

2.2.1 含陽(yáng)性克隆最大稀釋倍數(shù)的確定 從G10孔中取10 μL原擴(kuò)增文庫(kù)分別做10倍系列稀釋后進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)的最大稀釋倍數(shù)為 104(圖 2)。

2.2.2 含陽(yáng)性克隆板的確定 將收集的菌液做PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確定含強(qiáng)陽(yáng)性克隆的培養(yǎng)板為板3和板5(圖 3)。

2.3 陽(yáng)性克隆的鑒定 取上述105倍的稀釋液再進(jìn)行涂板、培養(yǎng)、收菌、PCR鑒定，經(jīng)幾輪篩選后，最后得到64個(gè)菌落，經(jīng)鑒定菌落A10為強(qiáng)陽(yáng)性，編號(hào)為 F993-G10-A10(圖 4)。

2.4 基因序列分析 陽(yáng)性克隆F993-G10-A10測(cè)序結(jié)果顯示，其序列長(zhǎng)621 bp，有完整的3'端。在線BLAST分析表明該序列與秀麗新桿線蟲的VIT基因家族成員(Vit1、Vit2、Vit3、Vit4和Vit5)有一定同源性。其推導(dǎo)的氨基酸序列與秀麗隱桿線蟲的VIT基因家族成員的氨基酸序列一致性分別為35%、35%、34%、34%和35%，相似性分別為55%、57%、54%、54%和53%。在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)BLASTn分析，在與其相匹配的序列中，E值小于2e-31的有47條，這些EST序列均來(lái)源于豬蛔蟲，它們的功能也相似于秀麗隱桿線蟲的VIT。該基因已錄入 GenBank(AM262190)。

本研究根據(jù)從豬蛔蟲雌蟲抑制消減文庫(kù)中選取的特異性EST序列設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用96孔板-PCR排除法對(duì)豬蛔蟲雌蟲cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得了豬蛔蟲雌蟲VIT基因。該陽(yáng)性克隆的獲得為該基因的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，也證明了96孔-PCR排除法是一種特異、高效、簡(jiǎn)便、成本低的篩選文庫(kù)方法。

[1]汪世平.醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2004.

[2]Inatomi Y,Murakami T,Tokunaga M,et al.Encephalopathy caused by visceral larva migrans due toAscaris suum[J].J Neu Sci,1999,164(2):195-199.

[3]徐碧玉，蘇偉，張建斌，等.香蕉果實(shí)SMART cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及利用PCR方法篩選香蕉Actin2基因[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2005，13(5)：375-380.

[4]Israel D I.A PCR-based method for high stringency screening of DNA libraries[J].Nucleic Acid Res,1993,21:2627-2631.

[5]Munroe D J,Loebbert R,Bric E,et al.Systematic screening of an arrayed cDNA library by PCR[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:2209-2213.

[6]魏冬霞，鄧艷，吳紹強(qiáng)，等.用SMART技術(shù)構(gòu)建豬蛔蟲雌蟲 cDNA文庫(kù)[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，29(3)：180-184.

[7]吳紹強(qiáng)，鄒豐才，翁亞彪，等.利用抑制消減雜交技術(shù)篩選豬蛔蟲性別差異表達(dá)基因[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(6)：1040-1045.