裴 磊，王國(guó)俊，熊 杰，李雁冰，姜永萍，陳化蘭

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001)

2005年，我國(guó)青海省發(fā)生嚴(yán)重的禽流感疫情，造成大量野鳥(niǎo)死亡[1]。此后，禽流感相繼在多個(gè)國(guó)家發(fā)生并對(duì)人類具有致病力。禽流感病毒(AIV)易于變異，多種動(dòng)物可充當(dāng)其生物載體，這給動(dòng)物和人類的健康帶來(lái)威脅，因此需要研制出有效的疫苗對(duì)其預(yù)防。

以 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(簡(jiǎn)稱 PR8)為內(nèi)部基因，利用反向遺傳操作技術(shù)制備的重組疫苗，具有應(yīng)用廣泛、安全性好、抗原成分齊全、誘導(dǎo)有效免疫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、亞型間交叉免疫保護(hù)能力強(qiáng)等特點(diǎn)[2]。A/Bar-headed goose/Qinghai/3/2005(BHGQH/05)H5亞型禽流感野鳥(niǎo)分離株的代表株，屬于2型(Clade 2.2)進(jìn)化支。本研究選擇BHGQH/05作為表面基因供體，PR8作為內(nèi)部基因供體[3-5]，利用反向遺傳操作技術(shù)制備具有高增殖特性，HA基因多個(gè)連續(xù)堿性氨基酸缺失的重組弱毒疫苗株，并在BALB/c小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)其免疫效力，以期作為人用H5亞型禽流感疫苗的技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料和方法

1.1 病毒株及內(nèi)部基因表達(dá)質(zhì)粒 病毒株BHGQH/05和A/Chiken/Vietnam/1180/2006(H5N1)(簡(jiǎn)稱CKVN/06)由本實(shí)驗(yàn)室保存；內(nèi)部基因的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒和聚合酶基因的蛋白表達(dá)質(zhì)粒均來(lái)自于PR8病毒株，由美國(guó)CDC的Kanta Subbarao博士饋贈(zèng)。

1.2 雞胚、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10日齡SPF雞胚由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；低代次Vero細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所；4周齡～6周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，所有小鼠感染實(shí)驗(yàn)均在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.3 HA和NA基因pBD雙向表達(dá)載體的構(gòu)建pBD載體的處理按照文獻(xiàn)[6]中的方法。根據(jù)BHGQH/05的HA、NA序列，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，按照文獻(xiàn)[8]中的方法擴(kuò)增HA和NA基因片段，并缺失HA基因上連續(xù)堿性氨基酸基因，序列測(cè)定正確后，將PCR產(chǎn)物在1 mM濃度的dCTP和dTTP存在的條件下分別連接到pBD載體中，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，提取重組質(zhì)粒，PCR鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定和分析。

1.4 病毒拯救 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)，提取質(zhì)粒，測(cè)定濃度。將這2個(gè)重組質(zhì)粒和其它PR8的10個(gè)重組質(zhì)粒共12個(gè)重組質(zhì)粒按參考文獻(xiàn)[7]的方法共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救，細(xì)胞液接種SPF雞胚尿囊腔。提取救獲病毒的RNA，RT-PCR擴(kuò)增病毒基因并測(cè)序鑒定。將病毒以106EID50/100 L接種于10日齡SPF雞胚，收集尿囊液分裝，-80℃保存，并命名為BHGQH/PR8。

1.5 病毒的純化和定量 將收集的尿囊液以30000 r/min超速離心，再經(jīng)過(guò)蔗糖密度梯度離心純化病毒液，用SDS-PAGE確定HA蛋白占總蛋白的百分比，測(cè)定總蛋白濃度，將病毒總蛋白稀釋至0.1 μg/μL，福爾馬林滅活，與等濃度Al(OH)3佐劑等體積混合，使混合液的病毒蛋白濃度為0.05 μg/μL，室溫震蕩過(guò)夜備用。

1.6 BALB/c小鼠的免疫保護(hù)試驗(yàn) 將小鼠隨機(jī)分為5組，20只/組，經(jīng)腿部肌肉免疫10 μg病毒蛋白。第1組為單劑量不加佐劑組，第2組為單劑量加佐劑組，第3組為加強(qiáng)免疫不加佐劑組，第4組為加強(qiáng)免疫加佐劑組，第5組為對(duì)照組(注射200 μL滅菌PBS)。單劑量和加強(qiáng)免疫4周后采血，分離血清，受體破壞酶處理，測(cè)定HI抗體和NT抗體滴度。上述5組小鼠在單劑量和加強(qiáng)免疫4周后各取一半，分別用100 MLD50劑量的同源病毒BHGQH/05和異源CKVN/06攻擊，攻毒后3 d每組剖殺3只，采集鼻咽部、腦、脾、腎和肺用于病毒分離滴定。連續(xù)觀察14 d，記錄體重變化和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 重組pBD雙向表達(dá)載體的構(gòu)建 按1.3中方法構(gòu)建含BHGQH/05的HA、NA基因的2個(gè)重組pBD載體。經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定，獲得與BHGQH/05的HA、NA基因一致且克隆位點(diǎn)和序列完全正確的2個(gè)重組質(zhì)粒。

2.2 重組病毒的救獲與鑒定 12個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救，擴(kuò)增救獲的病毒基因并測(cè)序，序列比較顯示救獲病毒無(wú)任何核苷酸序列的變化，其RNA完全來(lái)源于12個(gè)質(zhì)粒系統(tǒng)，表明救獲的病毒完全正確。

2.3 病毒HA蛋白的定量結(jié)果 根據(jù)蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)計(jì)算出總蛋白的濃度，同時(shí) SDSPAGE測(cè)定HA蛋白占總蛋白的百分?jǐn)?shù)，結(jié)果HA蛋白約為總蛋白含量的30%(圖2)。由這兩種方法確定HA蛋白的濃度以制定免疫劑量。

2.4 單劑量以及加強(qiáng)免疫后HI和NT抗體的測(cè)定結(jié)果 單次免疫能誘導(dǎo)產(chǎn)生與同源病毒反應(yīng)的HI抗體，抗體滴度為66.7；未檢測(cè)到與異源CKVN/06交叉反應(yīng)的HI抗體，也未檢測(cè)到與同源和異源病毒反應(yīng)的中和抗體。加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的HI和NT抗體滴度顯著上升，產(chǎn)生與同源和異源病毒反應(yīng)的高滴度HI和NT抗體(表1)。

表1 H5N1亞型滅活疫苗株單劑量和加強(qiáng)免疫小鼠后誘導(dǎo)產(chǎn)生的HI和NT抗體Table 1 Serum HI and NT antibodies elicated in mice following a single dose and two doses of H5N1 subtype in-activated vaccine

2.5 免疫小鼠用同源和異源病毒攻擊的體重變化和死亡結(jié)果 用同源和異源病毒攻擊的所有單劑量和加強(qiáng)免疫組小鼠體重均呈上升趨勢(shì)，無(wú)發(fā)病或死亡情況。而對(duì)照組小鼠體重在第3 d開(kāi)始顯著下降，并在11 d內(nèi)全部死亡(圖3，圖4)。

2.6 免疫小鼠用同源和異源病毒攻擊的臟器滴定結(jié)果 單劑量免疫對(duì)照組多個(gè)臟器分離到病毒，肺臟和鼻咽部檢測(cè)到高滴度病毒，而免疫組的肺臟和鼻咽部檢測(cè)的病毒量比對(duì)照組低，同時(shí)，佐劑的加入能夠降低組織中的病毒含量。加強(qiáng)免疫組小鼠產(chǎn)生完全免疫保護(hù)，其肺和鼻咽部未檢測(cè)到病毒，而對(duì)照組小鼠檢測(cè)到高滴度的病毒，脾、腎和腦也檢測(cè)到病毒(圖5，圖6)。

3 討論

本研究開(kāi)展了Clade 2.2 H5N1亞型AIV BHGQH/05滅活疫苗株的構(gòu)建及其對(duì)小白鼠免疫效力評(píng)價(jià)的研究工作，選用Vero細(xì)胞系作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞以救獲疫苗株，為該疫苗進(jìn)一步在靈長(zhǎng)類動(dòng)物的免疫評(píng)價(jià)打好基礎(chǔ)，并為將來(lái)的臨床試用提供可能。

目前已有的成人流感疫苗的免疫程序只有單次免疫。但是本研究結(jié)果顯示，采取加強(qiáng)免疫更利于對(duì)還未產(chǎn)生免疫記憶的H5N1流感病毒的免疫，加強(qiáng)免疫能顯著提高抗體水平，對(duì)較高劑量的同源和異源病毒的攻擊提供完全保護(hù)。單次免疫雖然對(duì)BALB/c小白鼠提供100%保護(hù)，但肺和鼻咽部檢測(cè)含有病毒，而且只能檢測(cè)到低水平的NT抗體和HI抗體，這與最近的文獻(xiàn)報(bào)道一致。較低的抗體水平卻能產(chǎn)生有效保護(hù)，其具體機(jī)制目前還不甚清楚，但下面兩個(gè)因素對(duì)解釋這種機(jī)制提供了參考。其一，Hoffmann等發(fā)現(xiàn)用某H5N1病毒株研制成疫苗，產(chǎn)生低水平的HI抗體，但是HA基因上單個(gè)S223N的替換即可顯著提高抗體水平[9]；其二，細(xì)胞免疫反應(yīng)也可能發(fā)揮重要作用[10]。

此外，本研究還是國(guó)內(nèi)首次采用野鳥(niǎo)中分離的AIV作為HA和NA基因供體制作疫苗，將對(duì)預(yù)防野鳥(niǎo)引起的禽流感暴發(fā)發(fā)揮重要作用。研制的滅活疫苗能夠?qū)?型進(jìn)化支的異源病毒攻擊提供良好的免疫保護(hù)，顯示其具有良好的應(yīng)用前景，是我國(guó)防控高致病性禽流感的有效的儲(chǔ)備疫苗毒株。

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