趙風(fēng)強(qiáng)，路義鑫，韓彩霞，張曉波，蘭 靜，宋銘忻*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱150086)

旋毛蟲(Trichinella spiralis)是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲，其肌幼蟲主要寄生于橫紋肌，成蟲寄生于小腸黏膜。Gilbert等發(fā)現(xiàn)旋毛蟲肌幼蟲和小鼠骨骼肌中的脂肪酸成份相似，但是不同脂肪酸占總脂肪酸的比例具有顯著差異[1]。其他寄生蠕蟲體內(nèi)的脂肪酸成份與在其宿主寄生部位的脂肪酸有明顯的關(guān)系，如曼氏血吸蟲和馬來絲蟲等，可隨宿主食物的改變而改變，但與宿主的脂肪酸組成和作用有明顯不同[2-3]。脂肪酸不僅是寄生蟲細(xì)胞膜的重要組成成分，而且在蟲體的營養(yǎng)吸收、生長發(fā)育以及抵御宿主抗寄生蟲反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用[4]。因此，本研究應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對(duì)旋毛蟲肌幼蟲和成蟲及各自寄生部位的脂肪酸成份進(jìn)行分析，比較旋毛蟲肌幼蟲與成蟲之間的脂肪酸組分的差異，為研究旋毛蟲的脂肪酸合成與代謝以及與宿主間的相互關(guān)系奠定基礎(chǔ)，并為開發(fā)抗旋毛蟲藥物和研制疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 蟲種及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 旋毛蟲隔離種由本教研室保種；昆明小鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量為20 g左右，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)。

1.2 主要試劑及儀器 RS-Fluka Methyl Tricosanoate、RS-Aldrich Boron Trifluoride-Methanol-Complex 和RS-Supelco Supelco 37 componet Fame Mix均購自Sigma公司；Agilent 6890/5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；OA-SYS/NEVAP氮吹儀為美國Organomation Associates Jnc公司產(chǎn)品。

1.3 樣本的制備 取旋毛蟲肌幼蟲，經(jīng)口感染10只成年健康昆明小鼠，感染量為200條/只，對(duì)照組10只口服生理鹽水，分別飼養(yǎng)。小鼠于感染后7 d和35 d迫殺，收集成蟲和肌幼蟲，同時(shí)采集對(duì)照組小鼠的骨骼肌和腸黏膜。

1.4 脂肪酸的提取及甲酯化 分別稱取旋毛蟲肌幼蟲、成蟲、小鼠骨骼肌和腸黏膜各50 mg，低溫真空干燥。樣品在玻璃勻漿器中進(jìn)行均質(zhì)化，按照文獻(xiàn)[5]方法提取總脂類，甲酯化后，加入1 mL正己烷和少量生理鹽水，靜止分層，吸取上層正己烷相進(jìn)行GC-MS分析。

1.5 色譜分析程序 60℃2 min；以10℃/min的速率升溫至190℃，保持2 min；以4℃/min的速率升溫至240℃，保持5 min，實(shí)驗(yàn)共計(jì)34.5 min。分析所得總離子流色譜圖均以峰面積歸一法進(jìn)行定量，以Agilent 5973 MSD Chemstation date analysis system進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并按照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行精密度試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 方法的精密度 按照文獻(xiàn)[6]方法驗(yàn)證其精密度，經(jīng)對(duì)各主要脂肪酸含量測定與分析，5次進(jìn)樣的變異系數(shù)均小于5.0%，表明精密度較高。

2.2 樣品中脂肪酸定性分析 采用色譜分析方法，分別對(duì)FAMEs標(biāo)準(zhǔn)品(圖1)、旋毛蟲肌幼蟲和成蟲的脂肪酸以及小鼠骨骼肌和腸黏膜的脂肪酸組成進(jìn)行GC-MS定性分析(圖2)。其中FAMEs標(biāo)準(zhǔn)品分析結(jié)果表明：檢出C8～C24之間的35種脂肪酸甲酯，但未檢出C4∶0和C6∶0。利用NIST檢索和標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖對(duì)4種樣品的質(zhì)譜圖進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示：旋毛蟲肌幼蟲、成蟲與小鼠骨骼肌、腸黏膜中的主要脂肪酸為在碳鏈長度上主要分布于C12～C22的多種脂肪酸；各色譜峰所代表的脂肪酸種類見圖2。

2.3 樣品中脂肪酸定量分析 采用色譜分析方法，對(duì)旋毛蟲肌幼蟲和成蟲的脂肪酸、感染旋毛蟲的小鼠骨骼肌與腸黏膜的脂肪酸組成及脂肪酸甲酯進(jìn)行定量分析(表1)。結(jié)果顯示：旋毛蟲肌幼蟲、成蟲與小鼠骨骼肌、腸黏膜中所含的主要脂肪酸種類基本相同，只有少數(shù)脂肪酸在性質(zhì)和數(shù)量上略有不同。

旋毛蟲肌幼蟲、成蟲與小鼠骨骼肌、腸黏膜的飽和脂肪酸相對(duì)含量分別為59.36%±0.72%、48.67%±0.69%、45.68%±0.28%和 44.5%±0.82%，其中主要飽和脂肪酸的相對(duì)含量為C18∶0和C16∶0；單不飽和脂肪酸的相對(duì)含量分別為16.3%±0.36%、44.65%±0.86%、26.82%±0.39%和13.08%±0.21%，以C18∶1為主；多不飽和脂肪酸的相對(duì)含量分別為23.84%±0.31%、6.68%±0.15%、27.48%±0.32%和42.05%±0.72%，其中以C18∶2和 C20∶4 為主。

部分樣品中痕量檢出 C20∶2、C20∶3 和 C22∶2。在旋毛蟲肌幼蟲和小鼠骨骼肌、腸黏膜脂肪酸組分中檢出長鏈多不飽和脂肪酸C22∶5和C22∶6，相對(duì)含量分別為 1.17%±0.01%、1.17%±0.03%，2.06%±0.03%、5.63%±0.05%和1.36%±0.02%、3.17%±0.02%。然而，在成蟲體內(nèi)未檢出該長鏈多不飽和脂肪酸的存在。C22∶6分別占旋毛蟲肌幼蟲和小鼠骨骼肌、腸黏膜多不飽和脂肪酸的4.9%、20.49%和7.54%。

3 討論

本研究采用GC-MS對(duì)旋毛蟲肌幼蟲和成蟲及其寄生部位的脂肪酸成份和甲酯化進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：4種樣品中的脂肪酸大部分為偶數(shù)脂肪酸，主要分布于C16、C18和C20中，涵蓋了各自總脂肪酸的90%以上。旋毛蟲肌幼蟲中飽和脂肪酸比例明顯高于成蟲和骨骼肌，這可能與肌幼蟲在肌肉組織中以包囊的形式寄生有關(guān)，即不直接與周圍組織接觸，但是肌幼蟲的能量攝取又來自于周圍的肌組織。因此，肌幼蟲與骨骼肌之間的脂肪酸組成既有相似點(diǎn)又存在明顯地差異。

表1 旋毛蟲肌幼蟲、成蟲和小鼠骨骼肌、腸黏膜的總脂類中的脂肪酸組成(X±SD，n=5)Table 1 Fatty acid composition of the total lipids of T.spiralismuscle larvae,adults,mouse skeletal muscle and intestinal mucosa(X±SD,n=5)

肌幼蟲中C20∶4相對(duì)含量明顯高于成蟲及骨骼肌中C20∶4的含量，這可能與肌幼蟲寄生于小鼠橫紋肌時(shí)C20∶4參與抵御外界炎癥反應(yīng)以及自身信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。腸黏膜中C20∶4的含量也較高，這也證明了C20∶4在炎癥反應(yīng)中的重要作用。

成蟲的主要脂肪酸為C16∶0和C18∶1，相對(duì)含量均明顯高于肌幼蟲，原因可能是成蟲為快速的生長、發(fā)育和繁殖，從宿主的食物中獲取豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，而肌幼蟲只需維持正常的生命活動(dòng)。因此，旋毛蟲在不同的發(fā)育階段脂肪酸組成存在差異。成蟲中不飽和脂肪酸相對(duì)含量較高，這可能與小鼠食物中的營養(yǎng)成分有關(guān)。成蟲既從腸黏膜周圍獲取能量，又要抵御腸黏膜的炎性反應(yīng)。因此從某種意義上成蟲的脂肪酸組成與腸黏膜必然存在差異。

本研究表明旋毛蟲肌幼蟲含有少量的長鏈多不飽和脂肪酸，如C22∶5和C22∶6。這些多不飽和脂肪酸可能在肌幼蟲的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。Ripatti等發(fā)現(xiàn)耐寒蟲種本地旋毛蟲含有足量的C22∶5和C22∶6，在抵御寒冷方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7]。然而，肌幼蟲如何獲得這些長鏈多不飽和脂肪酸，目前未見報(bào)道。

近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)旋毛蟲肌幼蟲具有抗腫瘤作用[8]，而C22∶6也同樣被證明具有提高免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)育的作用[9]，C22∶6是否是旋毛蟲發(fā)揮抑制腫瘤作用的重要因素之一，還有待于進(jìn)一步研究。本研究為研究旋毛蟲發(fā)育過程中脂肪酸的變化提供依據(jù)，并且為進(jìn)一步研究旋毛蟲的脂肪酸合成代謝機(jī)制提供思路，對(duì)開發(fā)新的抗旋毛蟲藥物和研制疫苗具有重要的意義。

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