李茹 韓瑾 李東至 廖燦

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心,廣東廣州 510623)

血友病A(hemophilia A,HA)又稱甲型血友病,是最常見的1種遺傳性出血性疾病,在男性中的發(fā)病率為1/5 000～/10 000[1],約占先天性出血性疾病的85%。HA是由凝血因子VIII(F8)基因缺陷引起,導(dǎo)致凝血因子VIII含量不足或功能缺陷而造成凝血障礙,呈X連鎖隱性遺傳方式。根據(jù)患者血漿凝血因子VIII促凝活性及癥狀嚴(yán)重程度可分為輕、中、重3型,分別占 HA 患者的40%、10%和50%[2]。目前,HA尚無有效根治療法,開展HA攜帶者檢測(cè)和產(chǎn)前診斷,阻斷致病基因傳遞,防止新的HA患兒出生,是降低HA發(fā)病率的有效辦法。

為提高HA攜帶者和患者的檢出率,本研究聯(lián)合應(yīng)用倒位PCR(inversion-PCR,I-PCR)、序列特異性PCR、高分辨熔解曲線分析法(high-resolution melting,HRM)、DNA測(cè)序等方法進(jìn)行F8基因缺陷檢測(cè),對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行了直接基因診斷,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 7例HA患者及相關(guān)家系成員(包括患者5例,其中1例患者的母親和1例患者的姐姐)和1例產(chǎn)前診斷樣本均由廣州市婦女兒童醫(yī)療中心遺傳咨詢門診和血液科提供。

1.2 DNA提取 患者及家系成員取靜脈血4 ml,1例產(chǎn)前診斷病例在孕27周時(shí)經(jīng)腹穿刺抽取臍帶血2 ml,均用EDTA抗凝。DNA提取采用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,TIANGEN)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 I-PCR檢測(cè)內(nèi)含子22倒位 引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[3,4],根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度進(jìn)行判斷。正常人的I-PCR產(chǎn)物片段為487 bp,內(nèi)含子22倒位者產(chǎn)物片段為559 bp,倒位攜帶者產(chǎn)物片段為487 bp和559 bp 2條帶。

1.3.2 PCR檢測(cè)內(nèi)含子1倒位 對(duì)內(nèi)含子22倒位陰性者,進(jìn)一步檢測(cè)內(nèi)含子1倒位。按文獻(xiàn)[5]方法操作,分別擴(kuò)增F8基因內(nèi)含子1中的Int1h-1片段及F8基因外的Int1h-2片段,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察電泳條帶。對(duì)int1h-1片段,若PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)為1908 bp為正常,1323bp為倒位,攜帶者有此2條帶;對(duì)int1h-2片段,若產(chǎn)物片段長(zhǎng)為1191 bp為正常,1776 bp為倒位,攜帶者有此2條帶。

1.3.3 HRM和DNA測(cè)序檢測(cè)點(diǎn)突變 對(duì)內(nèi)含子22和1倒位陰性者,首先將男性患者的DNA與正常男性的DNA以1:1比例混合,引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[6,7],PCR擴(kuò)增F8基因所有外顯子及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū),然后應(yīng)用高分辨熔解曲線分析儀LightScanner進(jìn)行突變掃描,對(duì)篩查陽性片段進(jìn)一步作測(cè)序分析確定致病突變。

2 結(jié)果

2.1 F8基因內(nèi)含子22倒位 4例HA患者擴(kuò)增得到559 bp的片段,為第22內(nèi)含子倒位者,這其中1位患者的母親擴(kuò)增得到487 bp和559 bp2個(gè)片段,為倒位攜帶者。結(jié)果見圖1。此倒位攜帶者母親于孕27周抽取臍帶血進(jìn)行產(chǎn)前診斷,胎兒性別為男性,I-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段為559 bp,診斷為HA患者。余1例HA患者及其姐姐未檢出內(nèi)含子22倒位。

圖1 I-PCR檢測(cè)內(nèi)含子22倒位電泳結(jié)果

2.2F8基因內(nèi)含子1倒位 對(duì)未檢出內(nèi)含子22倒位的HA患者及其姐姐進(jìn)行內(nèi)含子1倒位檢測(cè)。對(duì)int1h-1片段,PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)1 908 bp,為正常;對(duì)int1h-2片段,PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)為1 191 bp,為正常。因此排除內(nèi)含子1倒位突變。結(jié)果見圖2。

圖2 PCR檢測(cè)內(nèi)含子1倒位電泳結(jié)果

2.3F8基因點(diǎn)突變 對(duì)上述內(nèi)含子22和1倒位陰性的HA患者,采用HRM 進(jìn)行突變掃描,結(jié)果顯示第8外顯子存在異常熔解曲線(圖3),經(jīng)直接測(cè)序分析鑒定為第329位密碼子錯(cuò)義突變 TGT→TAT(圖4),即 c.986G ＞A(p.Cys329Tyr)。此突變已在HAMSTeRS數(shù)據(jù)庫有報(bào)導(dǎo)。該患者姐姐經(jīng)檢測(cè)確診為此錯(cuò)義突變攜帶者(圖4)。

圖3 F8基因第8外顯子HRM突變篩查結(jié)果

3 討論

F8基因位于Xq28,大小約 186 kb,由26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子組成,mRNA大小約9kb,基因結(jié)構(gòu)龐大。已知重型患者中近50%為內(nèi)含子22的倒位突變[8],近年來發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1倒位是僅次于內(nèi)含子22倒位導(dǎo)致重型HA的常見原因[5,9]。除此之外,大部分患者則多為點(diǎn)突變,目前已知有797種(HAMSTeRS數(shù)據(jù)庫),且無突變熱點(diǎn),多數(shù)散亂。

圖4 F8基因第8外顯子測(cè)序圖部分序列

隨著對(duì)血友病A分子基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)不斷深入,該病的基因診斷技術(shù)也得到很大發(fā)展。F8基因突變的診斷方法主要分為2類:直接基因診斷和間接基因診斷。

血友病 A的直接基因診斷技術(shù)主要包括Southern 雜交、LD-PCR(long-distance PCR)、SSCP(single strand conformation polymorphism)、DGGE(denatured gradient gel electrophoresis)及DHPLC(denatured high performance liquid chromatography)等。對(duì)于最常見的內(nèi)含子22倒位突變目前大多采用LD-PCR進(jìn)行檢測(cè)[10]。但 LDPCR專用酶及deaza-dGTP等的試劑價(jià)格昂貴,成本較高。近期出現(xiàn)的1種新技術(shù)即I-PCR,也用于檢測(cè)第22內(nèi)含子倒位,與LD-PCR相比,由于擴(kuò)增產(chǎn)物片段較短,大大減小了擴(kuò)增難度,而且該方法對(duì)DNA樣本的要求較低[11]。其他突變種類則多為點(diǎn)突變,一般先采用SSCP、DGGE或DHPLC的方法篩查突變,然后經(jīng)測(cè)序明確致病突變。

本研究采用I-PCR進(jìn)行第22內(nèi)含子倒位患者及攜帶者的檢測(cè),并成功完成了1例產(chǎn)前基因診斷。F8基因的突變篩查則采用HRM技術(shù)。HRM是近年來發(fā)展的1種用于突變掃描和基因分型的最新遺傳學(xué)分析方法。它是1種高效穩(wěn)健的post-PCR技術(shù),不受突變堿基位點(diǎn)與類型的局限,無需序列特異性標(biāo)記探針,PCR結(jié)束后直接運(yùn)行熔解曲線分析,5分鐘即可完成對(duì)樣品的結(jié)果分析。這種方法因其操作簡(jiǎn)便快捷、成本低廉、結(jié)果準(zhǔn)確,且可實(shí)現(xiàn)高通量(96或384孔板),因此尤其適用于測(cè)序前的大規(guī)模突變篩查,是1種高靈敏度高特異性的核酸突變篩查技術(shù)。本研究通過采用LightScanner進(jìn)行HRM分析,可在2小時(shí)內(nèi)(包括PCR反應(yīng)和HRM分析)完成對(duì)F8基因全部26個(gè)外顯子的突變篩查,且單孔單樣本的檢測(cè)成本僅為2.5元。篩查結(jié)果顯示1例HA患者第8外顯子存在異常熔解曲線,經(jīng)測(cè)序確定為c.986G＞A(p.Cys329Tyr)錯(cuò)義突變。致病突變和多態(tài)性位點(diǎn)都可以導(dǎo)致異常熔解曲線,因此應(yīng)用HRM篩查得到異常熔解曲線時(shí),須經(jīng)測(cè)序以確定所檢測(cè)到SNP(single nucleotide polymorphism)的性質(zhì)。對(duì)于已知的SNP,可在數(shù)據(jù)庫中檢索以明確其性質(zhì);對(duì)于新發(fā)突變,還需在正常對(duì)照人群(家系中正常人及無血緣關(guān)系健康人)中作進(jìn)一步篩查以確定其致病性。

血友病A的間接基因診斷即為家系連鎖分析,主要依靠 RFLP(restrictionfragment length polymorphism)、STR(shorttandem repeat)、VNT R(variable number of tandem repeats)等多態(tài)性標(biāo)記與致病突變等位基因的連鎖關(guān)系及其向后代的傳遞情況進(jìn)行診斷[12,13]。然而間接基因診斷存在顯著局限性,如不能明確突變性質(zhì),可因基因內(nèi)重組的發(fā)生而導(dǎo)致誤診,或家系成員無法提供多態(tài)信息等使診斷受到限制,對(duì)于新發(fā)、散在病例更無法診斷。

總的來說,由于現(xiàn)有技術(shù)的局限性,加上基因突變的多樣性,部分家系在目前的條件下尚無法做出判斷。特別是對(duì)于新突變?cè)斐傻纳l(fā)性血友病家系,診斷率更低。因此,HA的基因診斷不能只單獨(dú)依靠1項(xiàng)檢測(cè)手段。本研究即聯(lián)合應(yīng)用I-PCR、序列特異PCR、HRM、DNA測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)所有研究對(duì)象的直接基因診斷。在臨床實(shí)踐中對(duì)于有先證者的家系,應(yīng)首先對(duì)先證者依次進(jìn)行以下檢測(cè):①采用I-PCR檢測(cè)內(nèi)含子22倒位;②排除內(nèi)含子22倒位后,采用序列特異PCR檢測(cè)內(nèi)含子1倒位;③若排除以上2種倒位突變,則應(yīng)用HRM進(jìn)行點(diǎn)突變篩查,然后測(cè)序確定致病突變。在明確先證者致病突變后,再進(jìn)一步對(duì)家系中其他患者和可能攜帶者進(jìn)行檢測(cè)。本研究所提出的HA的直接基因診斷策略,簡(jiǎn)便快捷、經(jīng)濟(jì)有效,可進(jìn)一步提高現(xiàn)有診斷的有效率和準(zhǔn)確性,在HA的基因診斷及產(chǎn)前診斷中具有較強(qiáng)的實(shí)用性,適于在臨床推廣應(yīng)用。今后將進(jìn)一步提高樣本量來進(jìn)行實(shí)踐驗(yàn)證,逐步建立起一套完善的直接基因診斷體系,以提高血友病A的診斷率,并豐富中國(guó)人群血友病A的基因突變譜。

[1]Scriver CR,Beaudet AL,Sly WS,et al.The metabolic and molecular bases of inherited disease[M].7th ed.New Yo rk:McGraw-Hill,1995.

[2]Antonarakis SE,Rossiter JP,Young M,et al.Factor VIII gene inversions in severe hemophilia A:results ofan international consortium study[J].Blood,1995,86:2206-2212.

[3]Rossetti LC,Radic CP,Larripa IB,et al.Genotyping the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR[J].Clin Chem,2005,51:1154-1158.

[4]Qi LY,Jin CL, Lin CK,et al.A pplication study on inversion diagnosis of F8 gene in hemophilia A[J].Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi,2007,24:405-408.

[5]Bagnall RD,Waseem N,Green PM,et al.Recurrent inversion breaking intron l of the facto r VIII gene is a frequent cause of severe hemopilia A[J].Blood,2002,99:168-174.

[6]Laurie AD,Smith MP,George PM.Detection of Factor VIII Gene Mutations by High-Resolution M elting Analy sis[J].Clin Chem,2007,53:2211-2214.

[7]Lin SY,Su YN,Hung CC,et al.Mutation spectrum of 122 hemophilia A families from Taiwanese population by LDPCR,DHPLC,multiplex PCR and evaluating the clinical application of HRM[J].BMC Medical Genetics,2008,20:53.

[8]Lakch D,Kazazion HH,Antonarakis SE,et al.Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe hemophilia A[J].Nat Genet,1993,5:236.

[9]Tizzano EF,Cornet M,Baiget M.Inversion of intron 1 ofthe factorVIIIgene fordirectmoleculardiag nosis of hemophilia A[J].Haematologica,2003,88:118-120.

[10]M antilla-Capacho JM,Beltrán-Miranda CP,Luna-Záizar H,et al.Frequency of intron 1 and 22 inversions of Factor VIII gene in Mexican patients with severe hemophilia A[J].Am J Hematol,2007,82:283-287.

[11]Rossetti LC,Radic CP,Larripa IB,et al.Genoty ping the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR[J].Clin Chem,2005,51:1154-1158.

[12]陸曄玲,丁秋蘭,戴菁,等.血友病攜帶者與產(chǎn)前基因診[J].中國(guó)輸血雜志,2008,21:259-264.

[13]張立,余元?jiǎng)?吳競(jìng)生.血友病A基因診斷和產(chǎn)前診斷技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2007,15:4-6.