陳黎紅， 謝曉英， 楊 川， 嚴(yán) 勵， 朱 平， 勞國娟， 郝少云

(中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510120)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)又稱高半胱氨酸，是一種反映血管損傷的含硫非必需氨基酸，為蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，參與甲基的轉(zhuǎn)移。大量研究表明，高Hcy血癥發(fā)生率在糖尿病人群中明顯高于非糖尿病人群，且伴高Hcy血癥病人的血管、神經(jīng)并發(fā)癥明顯增高［1］;另外還發(fā)現(xiàn)，Hcy可通過多種途徑影響慢性傷口的愈合［2］，同時對基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，MMPs/TIMPs)有一定的調(diào)節(jié)作用［3］。眾所周知，糖尿病足是與血管神經(jīng)病變密切相關(guān)的以皮膚慢性難愈性傷口為特征的糖尿病常見并發(fā)癥，眾多研究表明糖尿病足組織以及傷口滲液中MMP－9表達(dá)量明顯增高是造成糖尿病皮膚易損性增加以及傷口難愈性的一個重要因素［4］。那么糖尿病患者血中高同型半胱氨酸是否通過MMP－9途徑影響糖尿病足的愈合呢?為了探討二者之間可能的關(guān)系，本研究進(jìn)行相關(guān)離體細(xì)胞實驗，采用高糖及高同型半胱氨酸刺激大鼠皮膚成纖維細(xì)胞，觀察其對MMP－9表達(dá)量及酶活性的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 1 d齡SD大鼠乳鼠。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Hyclone;Hcy購自Fluka;Trizol試劑購自Invitrogen;RT試劑盒購自Promega;PCR引物由上海生工公司合成;PCR試劑盒購自Fermentence;小鼠抗大鼠MMP－9單克隆抗體、小鼠抗大鼠甘油醛－3－磷酸脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體、兔抗小鼠MMP－9Ⅱ抗、兔抗小鼠GAPDHⅡ抗均購自Abcam。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取1 d齡正常SD大鼠背部皮膚分離真皮成纖維細(xì)胞，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中原代培養(yǎng)。為避免混入其它細(xì)胞成分，需對原代細(xì)胞進(jìn)行鑒定:先將細(xì)胞用多聚甲醛室溫固定15 min，PBS沖洗之后滴加蛋白阻斷工作液，室溫孵育5 min，沖洗后滴加1∶800稀釋的小鼠抗大鼠波形蛋白Ⅰ抗4℃ 過夜，沖洗后滴加1∶400稀釋的生物素化羊抗鼠Ⅱ抗37℃ 10 min，緩沖液漂洗。DAB顯色5－10 min，蘇木精復(fù)染，光鏡下進(jìn)行觀察和鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為成纖細(xì)胞及其純度。細(xì)胞呈長梭形或星形，排列呈旋渦狀，柵欄狀或放射狀，呈現(xiàn)典型的成纖維細(xì)胞的形態(tài)及生長排列方式。胞漿波形絲蛋白［小鼠抗大鼠波形絲蛋白單克隆抗體(mouse antivimentin)］染色呈強陽性證實該細(xì)胞為中胚層來源，可以確定該細(xì)胞就是皮膚成纖維細(xì)胞。待1瓶細(xì)胞接近融合時，0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代。選生長狀態(tài)良好的2－4代細(xì)胞進(jìn)行實驗或凍存，凍存細(xì)胞用胰酶消化、PBS清洗離心后，加入配好的細(xì)胞凍存液(血清∶培養(yǎng)液∶DMSO=7∶2∶1)，充分混勻后轉(zhuǎn)置細(xì)胞凍存管于4℃ 30 min，轉(zhuǎn)放－20℃ 30 min，再轉(zhuǎn)入－80℃或液氮氣相過夜后即可轉(zhuǎn)移到液氮液相內(nèi)(－196℃)，標(biāo)記好細(xì)胞名稱及時間，以備后期使用。

2.2 不同濃度葡萄糖及Hcy處理 取2－4代細(xì)胞進(jìn)行24 h血清剝奪(0.5%FBS)后，分3組如下更換培養(yǎng)基:(A)正常糖濃度組:含5.5 mmol/L葡萄糖、10%FBS的 DMEM培養(yǎng)基;(B)高糖組:含22 mmol/L葡萄糖、10%FBS的DMEM培養(yǎng)基;(C)高糖+高Hcy組:含22 mmol/L葡萄糖、10%FBS和100 μmol/L Hcy的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h。后繼用于明膠酶譜法檢測上清蛋白的用0.5%FBS低血清培養(yǎng)，其余同上。

2.3 RT－PCR檢測MMP－9 mRNA表達(dá)量 提取細(xì)胞中總RNA后經(jīng)紫外分光光度計檢測純度和濃度，經(jīng)電泳法檢測完整性。符合要求的總RNA以逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcript－polymerase chain reaction，RT－PCR)半定量檢測 MMP－9 mRNA水平，以GAPDH作為內(nèi)參照。引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件。電泳結(jié)束后拍照，以Image Quant 5.2凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

2.4 Western blotting檢測MMP－9蛋白表達(dá)量 提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，用MiniBCA法測定蛋白濃度，再通過蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)來測定MMP－9蛋白質(zhì)水平，以GAPDH作為內(nèi)參照。在暗室中用X光膠片曝光，用Image Quant 5.2軟件對條帶進(jìn)行密度掃描，以面積×密度代表MMP－9蛋白的表達(dá)量，以目的蛋白與內(nèi)參照的比值代表目的蛋白相對水平。

2.5 明膠酶譜法檢測MMP－9蛋白酶活性 低血清(0.5%FBS)培養(yǎng)細(xì)胞，提取等量細(xì)胞的等量上清液，MiniBCA法測定提取物中蛋白質(zhì)濃度，上樣于含1%明膠的SDS－PAGE膠內(nèi)電泳。電泳結(jié)束后用含2.5%Triton X－100的洗脫液室溫30 min洗脫SDS，再用漂洗液漂洗。將漂洗后的凝膠置于含Ca2+、Zn2+孵育液中37℃孵育48 h。孵育后用蒸餾水漂洗凝膠，0.5%考馬斯亮藍(lán)染色，蒸餾水漂洗后脫色液脫色至藍(lán)色凝膠上出現(xiàn)被明膠酶消化的透明條帶(MMP－9，92 kD)。拍照后Image Quant 5.2凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 大鼠皮膚成纖維細(xì)胞鑒定

在倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈長梭形或星形，排列呈漩渦狀或放射狀，為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)和排列生長方式，見圖1。免疫組化染色胞漿波形絲蛋白強陽性，提示細(xì)胞來源于中胚層，為成纖維細(xì)胞，見圖2。

Figure 1.Morphology of rat dermal fibroblast cells under light microscope.Under inverted phase contrast microscope，cultured cells showed spindle and stellate shape and arranged in spiral－ like，radial morphology，indicating typical morphology and growth arrangement of dermal fibroblast cells.圖1 光鏡下大鼠皮膚成纖維細(xì)胞的形態(tài)

Figure 2.Immunochemistry of cultured fibroblast cells with anti－vimentin antibody.Strong positive staining of cytoplasma vimentin confirmed that the cells derived from mesoderm，which indicating the fibroblast－origin.圖2 大鼠皮膚成纖維細(xì)胞vimentin免疫組化

2 正常糖濃度、高糖及高糖+高Hcy處理后MMP－9 mRNA表達(dá)

與內(nèi)參照GAPDH比較，MMP－9 mRNA相對表達(dá)量在正常糖濃度組、高糖組、高糖+高Hcy組分別為1.51±0.47、1.75±0.56、1.90±0.33，高糖組和高糖+高Hcy組分別為正常糖濃度組的1.15倍和1.25倍。與正常糖濃度組比較，差異顯著，P＜0.05，見圖 3、4。

Figure 3.Gel electrophoresis of MMP－9 mRNA.Lane A:normal glucose group;Lane B:high glucose group;Lane C:high glucose plus high homocysteine group.The first line indicated MMP－9 mRNA of group A，B and C，the second line indicated GAPDH.The figure suggested that compared with internal control GAPDH，the amount of mRNA in group B and C were relatively more than that of group A.圖3 MMP－9 mRNA瓊脂凝膠電泳圖

Figure 4.Effects of high glucose and homocysteine on MMP－9 mRNA expression in rat fibroblasts.The relative expression normalized with GAPDH were 1.51±0.47，1.75±0.56，1.90 ±0.33 in normal glucose group，high glucose group and high glucose plus high homocysteine group，respectively..n=6.*P＜0.05 vs normal glucose group.圖4 正常糖濃度、高糖及高糖+高Hcy處理后MMP－9 mRNA表達(dá)量

3 正常糖濃度、高糖及高糖+高Hcy處理后MMP－9蛋白表達(dá)

與內(nèi)參照GAPDH比較，MMP－9蛋白相對表達(dá)量在正常糖濃度組、高糖組、高糖+高Hcy組分別為0.52±0.21，0.83±0.41，1.39±0.50，高糖組和高糖+高Hcy組分別為正常糖濃度組的1.59倍和2.63倍。與正常糖濃度比較，差異均顯著，P＜0.05，見圖5、6。

Figure 5.The expression of MMP－9 protein analyzed by Western blotting.Lane A:normal glucose group;Lane B:high glucose group;Lane C:high glucose plus high homocysteine group.The figure suggested that compared with internal control GAPDH，the amount of MMP－9 protein in group B and C were relatively more than that of group A.圖5 Western blotting檢測MMP－9蛋白表達(dá)

Figure 6.Expression of MMP－9 protein in rat fibroblasts treated with high glucose or/and homocysteine.The relative expression normalized with GAPDH were 0.52±0.21，0.83 ±0.41，1.39 ±0.50 in normal glucose group，high glucose group and high glucose plus high homocysteine group，respectively..n=6.#P＜0.05 vs normal glucose group.圖6 正常糖濃度、高糖及高糖+高Hcy處理后MMP－9蛋白表達(dá)量

4 正常糖濃度、高糖及高糖+Hcy處理后MMP－9蛋白活性

MMP－9蛋白表達(dá)活性在正常糖濃度組、高糖組、高糖 +高 Hcy組分別為 0.56±0.09、0.75±0.33、1.41±0.30，高糖組和高糖+高Hcy組分別為正常糖濃度組1.34倍和2.52倍。與正常糖濃度組比較，差異顯著，P ＜0.05，見圖7、8。

討 論

Hcy為一種含硫氨基酸，結(jié)構(gòu)式為 HSCH2(NH2)CO2H，是蛋氨酸代謝過程中的重要中間產(chǎn)物，參與甲基的轉(zhuǎn)移;血漿中存在氧化型和還原型Hcy兩種形式［5］。正常人體內(nèi)Hcy含量很少，一般人群血清Hcy正常范圍為5－15μmol/L，高Hcy血癥是指空腹或蛋氨酸負(fù)荷后血清Hcy濃度超過正常參考范圍。一般認(rèn)為輕度高Hcy血癥為16－30 μmol/L、中度 31 －100 μmol/L、重度 ＞100 μmol/L。

Figure 7.The activity of MMP－9.Lane A:normal glucose group;Lane B:high glucose group;Lane C:high glucose plus high homocysteine group.The figure suggested that MMP－9 activity in group B and C was relatively more than that of group A.圖7 MMP－9活性檢測

Figure 8.The activity of MMP－9 in rat fibroblasts treated with high glucose or/and homocysteine.The protein activity was 0.56 ±0.09，0.75 ±0.33 and 1.41±0.30 in normal glucose group，high glucose group and high glucose plus high homocysteine group，respectively..n=6，△P ＜0.05 vs normal glucose group.圖8 正常糖濃度、高糖及高糖+高Hcy處理后MMP－9活性

糖尿病患者由于胰島素缺乏或胰島素抵抗等因素，可能通過影響Hcy的分解代謝，導(dǎo)致高Hcy血癥。有人觀察了1型糖尿病空腹及蛋氨酸負(fù)荷后血Hcy的變化，發(fā)現(xiàn)1型糖尿病患者二者均較正常對照組明顯升高，高Hcy血癥發(fā)生率達(dá)35%，而健康人群僅為 8%(P ＜ 0.01)［6］。Buysschaert M［7］等的報道表明，2型糖尿病患者的血漿Hcy水平也明顯高于正常對照組，且糖尿病患者中高Hcy組的血管并發(fā)癥的發(fā)生率明顯高于正常Hcy組，其中以大血管病變尤為顯著，腎病發(fā)生率亦明顯增高。普遍認(rèn)為Hcy是一種血管損傷性氨基酸，它與糖基化終末產(chǎn)物有協(xié)同作用，可直接造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血管功能異常［8］，因此推測高Hcy血癥可能是糖尿病代謝異常的一個部分。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，傷口(尤其是慢性傷口)滲液中，Hcy含量明顯增高。全身及傷口中增高的Hcy可以通過多種途徑延遲傷口愈合，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制傷口NO生物活性［9］，下調(diào)TGF－β活性，在暫時的傷口基質(zhì)形成過程中可占據(jù)纖維蛋白單體的纖連蛋白位點而改變傷口肉芽組織的生成等［10］。但Hcy與MMP－9的表達(dá)之間的關(guān)系仍不清楚。

本實驗采用高糖及高Hcy刺激皮膚成纖維細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外高糖環(huán)境中成纖維細(xì)胞MMP－9表達(dá)量為正常糖濃度環(huán)境中的1.59倍(P＜0.05)，酶活性為后者的1.34倍(P＜0.05);而加了同型半胱氨酸之后表達(dá)量增高更為明顯，蛋白表達(dá)量與酶活性分別為正常糖濃度組的2.63倍、2.52倍(P＜0.05)。提示在糖尿病狀態(tài)下，高Hcy也參與了對MMP－9的調(diào)節(jié)，可進(jìn)一步增加高糖環(huán)境下成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP－9。

MMP與Hcy之間關(guān)系的機制尚不清楚。有研究認(rèn)為Hcy可能通過NF－κB激活機制刺激MMP－9的表達(dá)［11，12］;NF－ κB 在多種刺激物介導(dǎo)的 IL －6的轉(zhuǎn)錄激活過程中扮演著關(guān)鍵的角色，IL－6作為一種炎癥因子可以刺激MMPs的生成和活性。還有研究認(rèn)為Hcy可能通過激活PKC通路而刺激MMP－9的表達(dá)［13］。

綜上所述，Hcy與糖尿病以及其血管神經(jīng)的慢性并發(fā)癥關(guān)系密切，在慢性傷口的愈合過程中起著重要的作用，Hcy可能通過影響MMPs(尤其MMP－9)表達(dá)和平衡而參與了糖尿病足潰瘍的發(fā)生和發(fā)展。

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