孫 青， 孔麗娜， 宋蓉蓉， 李鐵臣

(1皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 蕪湖 241001;2皖南醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)研究室，安徽 蕪湖 241002)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis)是婦科最常見的疾病之一，患者表現(xiàn)為疼痛、不孕及其它癥狀［1－6］。子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性疾?。?－5］，育齡婦女中的發(fā)病率約 5% － 10%［1，2，4－6］，近年來，發(fā)病率逐年上升，其中近50%的患者導(dǎo)致不孕［1，4］，總體復(fù)發(fā)率高達(dá) 50% 以上［7］。目前，子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制尚不清楚［1，2］。有研究表明雌激素受體 α(estrogen receptor α，ERα)基因的 PvuⅡ和XbaⅠ的多態(tài)性可能參與了異位子宮內(nèi)膜的種植過程［2－4，6］，本研究采用 PCR －RFLP 和 DNA 序列測定方法檢測子宮內(nèi)膜異位癥患者和正常對照中這2個多態(tài)位點(diǎn)的分布情況，探討ERα基因多態(tài)性在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中的作用。

材料和方法

1 臨床資料

60例子宮內(nèi)膜異位癥標(biāo)本全部來自2007年12月至2009年10月弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科，均為婦科開腹或腹腔鏡手術(shù)中無菌采集的新鮮組織標(biāo)本，全部為卵巢子宮內(nèi)膜異位癥病例，取典型病灶部位?；颊邿o特殊疾病史，術(shù)前3個月內(nèi)未采用過激素治療，年齡22－50歲，平均年齡(37.5±6.6)歲。根據(jù)美國生育學(xué)會修正分期法(the revised American Fertility Society，r－AFS)(1985)分期:Ⅰ期7 例，Ⅱ期 21 例，Ⅲ期22例，Ⅳ期10例。

56例正常對照標(biāo)本全部來自2008年1月至2008年10月弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科，均為門診行診斷性刮宮的育齡婦女的正常子宮內(nèi)膜，增生期宮內(nèi)膜34例，分泌期宮內(nèi)膜22例，年齡32－58歲，平均年齡(43.0±6.2)歲。

以上所有標(biāo)本均經(jīng)鏡下病理檢查證實(shí)。

2 PCR

取50 mg左右的組織，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行組織勻漿，勻漿經(jīng)蛋白酶K消化，常規(guī)酚－氯仿抽提DNA，紫外分光光度計檢測DNA純度和濃度，4℃保存、備用。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)［NC_000006.11(152129500－152163731)］自行設(shè)計了1對PCR引物，上游引物序列為 5'－TCCAGGGTTATGTGGCAATGACG－3'，下游引物序列為5'－ACTACCTGCACCAGAATATGTTACCT－3'，擴(kuò)增的片段大小為278 bp，涵蓋 ERα基因的PvuⅡ和XbaⅠ2個多態(tài)位點(diǎn)。

PCR 總反應(yīng)體積50 μL:模板 DNA 為2 μL，Taq酶2.5 U，10 ×buffer 5 μL，MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上游及下游引物各 10 pmol/L，加ddH2O至總體積50 μL。反應(yīng)在PTC－150型熱循環(huán)儀(MJ公司)上進(jìn)行，98℃ 5 min蛋白變性后，加入Taq酶(Promega產(chǎn)品)，進(jìn)入熱循環(huán)，反應(yīng)條件為:94℃ 30 s;56℃ 40 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)，最后72℃ 4 min。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳60 min(電壓100 V)，溴化乙啶(ethidium bromide，EB)染色，紫外燈下檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3 限制性內(nèi)切酶酶切

限制性內(nèi)切酶PvuⅡ和XbaⅠ為Fermentas產(chǎn)品(#ER0631和#ER0681)，酶切反應(yīng)總體積 32 μL:PCR 產(chǎn)物10 μL，10 ×buffer 2 μL(PvuⅡ?yàn)?0 ×buffer G，XbaⅠ為 10 ×buffer Tango)，PvuⅡ或 XbaⅠ2 μL，加 ddH2O 至總體積32 μL。37 ℃水浴2－3 h，10 μL酶切產(chǎn)物加樣，1.5%瓊脂糖凝膠電泳(電壓100 V)，EB染色，紫外燈下檢測結(jié)果，數(shù)碼相機(jī)攝片保存。

4 DNA序列測定

PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠純化試劑盒(Axygen產(chǎn)品)純化回收，50 μL純化后的PCR產(chǎn)物連同其上、下游引物由南京金斯瑞生物科技有限公司，在ABI－3730XL測序儀上進(jìn)行單向測序(雙脫氧法)，必要時進(jìn)行雙向測序，觀察 PvuⅡ和 XbaⅠ多態(tài)位點(diǎn)的狀況。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用計數(shù)資料的構(gòu)成比表示，各組間陽性表達(dá)率采用SPSS 10.0軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

結(jié) 果

所有標(biāo)本均出現(xiàn)278 bp目標(biāo)帶。PvuⅡ酶切后，可產(chǎn)生 3種片段:278 bp、179 bp、99 bp，只有 1條278 bp帶的為PP(CC)型(突變型)，有179 bp、99 bp 2條帶的為pp(TT)型(野生型)，3條帶的為Pp(TC)型(雜合型)，相應(yīng)的測序結(jié)果PvuⅡ酶切位點(diǎn)的序列分別為:CAGCCG、CAGCTG和CAGCT/CG(T/C雜合)，見圖1－3。XbaⅠ酶切后，也可產(chǎn)生3種片段:278 bp、144 bp、134 bp，只有 1 條 278 bp 帶的為 XX(GG)型(突變型)，有144 bp、134 bp 2條帶的為 xx(AA)型(野生型)，3條帶的為 Xx(AG)型(雜合型)，相應(yīng)的測序結(jié)果XbaⅠ酶切位點(diǎn)的序列分別為:TCTGGA、TCTAGA和 TCTA/GGA(A/G雜合)，見圖4－6。

Figure 1.The photograph of PvuⅡdigestion in endometriosis.M:100 bp DNA ladder marker，from down to up:100 bp，200 bp，300 bp，400 bp…;Lane 1，2:homozygous mutant－type(C/C);Lane 3－5:homozygous wild－type(T/T);Lane 6－10:heterozygous genetype(T/C).圖1 子宮內(nèi)膜異位癥組中PvuⅡ酶切結(jié)果

Figure 2.The photograph of PvuⅡdigestion in normal endometrium.M:100 bp DNA ladder marker，from down to up:100 bp，200 bp，300 bp，400 bp…;Lane 1，2:homozygous mutant－type(C/C);Lane 3－6:homozygous wild－type(T/T);Lane7－10:heterozygous genetype(T/C).圖2 正常對照組中PvuⅡ酶切結(jié)果

PP型、Pp型、pp型、XX型、Xx型、xx型在子宮內(nèi)膜異位癥組和正常對照組中的分布見表1、2，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，2組間差異無顯著(P ＞0.05)，P、p以及 X、x的基因頻率在2組間差異也無顯著(P＞0.05)。

Figure 3.The sequence graph of PvuⅡrestriction sites.A:homozygous mutant－type(C/C);B:homozygous wild－type(T/T);C:heterozygous genetype(T/C).圖3 PvuⅡ酶切位點(diǎn)測序結(jié)果

Figure 4.The photograph of XbaⅠdigestion in endometriosis.M:100 bp DNA ladder marker，from down to up:100 bp，200 bp，300 bp，400 bp…;Lane 1:homozygous mutant－type(G/G);Lane 2－7:homozygous wild－type(A/A);Lane 8－11:heterozygous genetype(A/G).圖4 子宮內(nèi)膜異位癥組中XbaⅠ酶切結(jié)果

Figure 5.The photograph of XbaⅠdigestion in normal endometrium.M:100 bp DNA ladder marker，from down to up:100 bp，200 bp，300 bp，400 bp…;Lane 1:homozygous mutant－type(G/G);Lane 2－6:homozygous wild－type(A/A);Lane 7－11:heterozygous genetype(A/G).圖5 正常對照組中XbaⅠ酶切結(jié)果

Figure 6.The sequence graph of XbaⅠrestriction sites.A:homozygous mutant－type(G/G);B:homozygous wild－type(A/A);C:heterozygous genetype(A/G).圖6 XbaⅠ酶切位點(diǎn)測序結(jié)果

表1 ERα基因PvuⅡ多態(tài)性基因型和等位基因在子宮內(nèi)膜異位癥組和正常對照組中的分布Table 1.Genetype and allele distribuition of ERα gene PvuⅡpolymorphisms in endometriosis and normal endometrium［n(%)］

2種酶切結(jié)果組合分析，沒有出現(xiàn)PpXX、ppXX和ppXx 3種類型，其余基因型在2組間的分布見表3，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，2組間差異無顯著(P＞0.05)。PP型、Pp型、pp型、XX型、Xx型、xx型在子宮內(nèi)膜異位癥輕度患者組(Ⅰ、Ⅱ期)和重度患者組(Ⅲ、Ⅳ期)中的分布見表4、5，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，2組間差異無顯著(P＞0.05)。

表2 ERα基因XbaⅠ多態(tài)性基因型和等位基因在子宮內(nèi)膜異位癥組和正常對照組中的分布Table 2.Genetype and allele distribuition of ERα gene XbaⅠpolymorphisms in endometriosis and normal endometrium［n(%)］

表3 ERα基因多態(tài)性基因型在子宮內(nèi)膜異位癥組和正常對照組中的分布Table 3.Genetype distribuition of ERα gene polymorphisms in endometriosis and normal endometrium(n)

表4 ERα基因PvuⅡ多態(tài)性基因型在子宮內(nèi)膜異位癥輕度患者組和重度患者組中的分布Table 4.Genetype distribuition of ERα gene PvuⅡ polymorphisms in patients with endometriosis stage I/II and stage III/IV(n)

表5 ERα基因XbaⅠ多態(tài)性基因型在子宮內(nèi)膜異位癥輕度患者組和重度患者組中的分布Table 5.Genetype distribuition of ERα gene XbaⅠ polymorphisms in patients with endometriosis stage I/II and stage III/IV(n)

討 論

ERα基因位于6q25.1，長度大于140 kb，包含8個外顯子，7個內(nèi)含子［8］，在第1內(nèi)含子內(nèi)有2個單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)，可通過限制性內(nèi)切酶PvuⅡ和XbaⅠ酶切來檢測［2－4，9，10］。ERα 是核受體，具有轉(zhuǎn)錄因子作用，能調(diào)控其下游基因的活性［4］。一些研究表明，ERα基因的PvuⅡ和XbaⅠ的多態(tài)性對雌激素應(yīng)答的調(diào)節(jié)功能有影響，由此可能會對一些雌激素依賴性疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥)的發(fā)病產(chǎn)生作用［4，11］。

ERα基因的多態(tài)性與乳腺腫瘤和骨質(zhì)疏松癥發(fā)生之間的關(guān)系已被證實(shí)，但與子宮內(nèi)膜異位癥之間的關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究［11］。Govindan等［3］對110例印度的子宮內(nèi)膜異位癥患者和115例正常對照進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERα基因的PvuⅡ多態(tài)性CC基因型是印度婦女子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的危險標(biāo)志。Xie等［2］和 Hsieh 等［4］分別對中國大陸和臺灣的子宮內(nèi)膜異位癥患者進(jìn)行了研究，認(rèn)為ERα基因的PvuⅡ和XbaⅠ多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生密切相關(guān)。但Sato等［9］在對巴西人子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與ERα基因多態(tài)性的相關(guān)性研究中，得到了相反的結(jié)論，他們沒有發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者和正常對照組之間ERα基因的多態(tài)性有顯著差異。Kim等［10］也沒有發(fā)現(xiàn)韓國人的子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與ERα基因多態(tài)性相關(guān)。Luisi等［6］在意大利患者中，僅發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥的復(fù)發(fā)可能與ERα基因的多態(tài)性相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測定2種方法對ERα基因的多態(tài)性在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，ERα基因的PvuⅡ和XbaⅠ的多態(tài)性在子宮內(nèi)膜異位癥組和正常對照組中的分布，差異無顯著(P＞0.05)，與Sato等［9］、Kim 等［10］和 Luisi［6］等的觀點(diǎn)一致，而與 Xie等［2］、Govindan 等［3］和 Hsieh 等［4］的不同。這可能與采用的實(shí)驗(yàn)方法不同有關(guān)，上述的研究均是僅采用限制性內(nèi)切酶酶切方法得到的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)開始時，也是按文獻(xiàn)報道［2，4］的引物(上游 5'－ CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC －3'，下游 5'－TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA－3'，PCR產(chǎn)物1374 bp)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)酶切結(jié)果的重復(fù)性不盡理想，部分標(biāo)本PCR產(chǎn)物酶切后的殘留條帶對結(jié)果的評判有影響，于是重新自行設(shè)計了1對PCR引物，采用限制酶酶切和DNA測序2種方法進(jìn)行研究，當(dāng)兩者結(jié)果不符時，則重新摸索酶切條件并進(jìn)行反向測序驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA測序結(jié)果的重復(fù)性較高，優(yōu)于酶切的結(jié)果。

綜上所述，ERα基因的多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生之間的關(guān)系尚需作進(jìn)一步的研究，擴(kuò)大研究標(biāo)本量和采用DNA序列測定的方法是必要的。

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