張曉雪， 袁兆林， 朱 敏， 劉池波， 沈 波△， 徐 巍， 梁 勇， 王海寶

(1溫州醫(yī)學(xué)院附屬臺州醫(yī)院，浙江 臺州 317000;2浙江省臺州市立醫(yī)院，浙江 臺州 318000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種多系統(tǒng)性炎癥性的自身免疫性疾病，以慢性、進(jìn)行性及對稱性的多關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣?。目前用于RA檢測的實驗室診斷指標(biāo)存在敏感性、特異性上的局限，并不能達(dá)到早期診斷、早期治療的目的［1］?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展起來的一種蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物大分子研究，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可或缺的分析工具［2］。它在一定條件下，能夠?qū)悠贩肿与婋x成離子，然后測定這些離子的質(zhì)荷比(mass-to-charge，m/z)和強(qiáng)度，并繪制出蛋白指紋圖譜，進(jìn)一步對其進(jìn)行定性和定量分析。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)檢測、分析已確診的RA患者、骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)患者和健康體檢者的血清樣本，篩選出與RA疾病相關(guān)的特異性蛋白標(biāo)志物，建立RA診斷模型，提高RA的早期確診率。

材料和方法

1 材料

1.1 研究對象及分組 (1)RA組:60例(男26例，女34例)，年齡33-80歲，平均年齡(56.5±10.7)歲，診斷均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1987年修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。(2)OA組:35例(男15例，女20例)，年齡43-79歲，平均年齡(57.0±14.3)歲。(3)健康對照組:36名(男16名，女20名)，年齡42-70歲，平均年齡(57.7±7.5)歲，肝腎功能均正常，且無自身免疫性疾病史及重大疾病史。所有的研究樣本均來自2008年1月至2009年8月我院的門診/住院患者及健康體檢者。此項研究獲得了溫州醫(yī)學(xué)院附屬臺州醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并得到了病人和健康體檢者的知情同意。實驗對象的臨床及實驗室檢查基本情況見表1。

表1 實驗對象的臨床資料及分組信息Table 1.Clinical characteristics of the study subjects*

1.2 主要試劑及儀器 弱陽離子(weak cationic exchange，WCX)納米磁性微球購自北京賽爾迪生物技術(shù)有限公司。乙腈(acetonitrile，ACN)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、尿素、4-(2-羥乙基)哌嗪-4'-2-乙烷磺酸［4-(2-hydroxyethyl)piperazine-4'-2-ethanesulfonic acid，HEPES］、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)級別的水、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液［Tris(hydroxymethyl)aminoethane-HCl，Tris-HCl］、3-［3-(膽酰氨丙基)二甲銨基］丙磺酸內(nèi)鹽{3-［(3-cholamidopropyl)dimethylammonio］-1-propanesulfonate，CHAPS}、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、醋酸鈉(sodium acetate，NaAc)以及芥子酸(sinapinic acid，SPA)等試劑均購自Sigma。PBSⅡ-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀購自Ciphergen Biosystems。

2 方法

2.1 標(biāo)本采集與處理 采集空腹靜脈血5 mL于無抗凝劑的真空采血管中，立即放入4℃冰箱，靜置1 h，然后在4℃下4000×g離心10 min，將分離得到的血清以每份10 μL分裝，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 樣品檢測操作流程

①血清的預(yù)處理 將血清從-80℃冰箱內(nèi)取出，冰浴中解凍后，4℃下20000×g離心10 min，以去除殘留的細(xì)胞碎片。取5 μL血清，加10 μL U9裂解液(9 mol/L 尿 素，20 g/L CHAPS，10g/L DTT，50 mmol/L Tris-HCl，pH9.0)，充分混合后，室溫下孵育30 min，使血清蛋白變性。然后加入185 μL NaAc(100 mmol/L，pH4.0)，立即混勻。

②WCX納米磁性微球的活化 每個0.5 mL管中加入50 g/L WCX納米磁性微球50 μL，置于磁性分離板上分離 1 min，棄上清液，加入 100 μL NaAc，活化5 min，置于磁性分離板上分離1 min，棄上清液，反復(fù)2次。

③活化的WCX納米磁性微球捕獲血清蛋白 每份棄上清液活化的磁性微球中加入100 μL處理好的血清樣品，置于室溫孵育30 min。然后置于磁性分離板上分離1 min，棄上清液，再加入100 μL NaAc，洗脫5 min，置于磁性分離板上分離1 min，棄上清液，反復(fù)2次。

④洗脫WCX納米磁性微球上的血清蛋白 用5%(V/V)的TFA 10 μL將結(jié)合在磁性微球上的蛋白洗脫5 min，然后置于磁性分離板上分離1 min。取5 μL蛋白洗脫液加入5 μL飽和 SPA(50%ACN 和0.5%TFA)，充分混勻。吸取2 μL蛋白結(jié)晶混合物點樣于已清洗過的金芯片(此芯片僅作為載體使用，Au-chip，Ciphergen)上，自然晾干后，待上機(jī)檢測。⑤數(shù)據(jù)采集 采用PBSⅡ-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀檢測蛋白指紋圖譜。每次檢測前用塞弗吉公司提供的All-in-one標(biāo)準(zhǔn)多肽進(jìn)行校正，系統(tǒng)質(zhì)量偏差為0.1%。其參數(shù)設(shè)置如下，最高檢測分子質(zhì)量為50 kD，優(yōu)化范圍為2-20 kD，激光強(qiáng)度為180，檢測敏感度為7。

3 生物信息學(xué)分析

將血清樣本分成建模組和試驗組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。為了篩選出RA相關(guān)的特異性蛋白標(biāo)志物及在此基礎(chǔ)上建立RA的診斷模型，建模組隨機(jī)選入30例RA患者、20例OA患者和21名健康體檢者。為了評價診斷模型的敏感性及特異性，試驗組隨機(jī)選入30例RA患者、15例OA患者和15名健康體檢者，見表1。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Ciphergen ProteinChip和BioMarker Wizard軟件對芯片檢測得到的蛋白指紋圖譜進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。RA患者與OA患者和健康體檢者間的蛋白峰的比較采用t檢驗，將差異峰值的強(qiáng)度輸入Biomarker Pattern軟件，篩選出最具代表性的蛋白標(biāo)志物，并構(gòu)建出RA診斷模型。

結(jié) 果

1 用蛋白指紋圖譜技術(shù)分析血清蛋白質(zhì)組具有良好的可重復(fù)性

我們用WCX納米磁性微球處理后的同一健康者血清，點樣在金芯片的8個點上做重復(fù)性檢測，分析了血清中的多肽及低分子量蛋白質(zhì)組。被定義分析的主要蛋白峰強(qiáng)度的變異系數(shù)(coefficient of variance，CV)均在10%以內(nèi)，說明用這種方法來分析蛋白質(zhì)組具有良好的重復(fù)性，見圖1。

Figure 1.Protein spectra of serum samples from one healthy control.圖1 同一健康者血清的蛋白指紋圖譜

2 血清標(biāo)本蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測

歸一化后的蛋白質(zhì)指紋圖譜分析(圖2)表明，每例標(biāo)本在m/z為2-20 kD范圍內(nèi)均能檢測出約105個蛋白峰，其中處于m/z為2-10 kD的約89個，m/z為10-20 kD約16個。

3 RA組和對照組之間的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜分析

用MALDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合WCX納米磁性微球，對建模組的30例RA患者和41名對照者(20例OA患者和21名健康者)的血清樣本進(jìn)行蛋白指紋圖譜分析，通過Ciphergen ProteinChip和BioMarker Wizard軟件對所測得的蛋白指紋圖譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并在m/z為2-20 kD內(nèi)發(fā)現(xiàn)了33個具有顯著差異的蛋白峰(P＜0.05)，見表2。在這些差異蛋白質(zhì)中，與對照組相比，RA組有13個高表達(dá)，20個低表達(dá)。

Figure 2.Protein spectra of normalization.圖2 歸一化后血清蛋白指紋圖譜

表2 RA組和對照組間的33個差異蛋白峰Table 1.Thirty-three discriminating m/z peaks were found with differential expression levels in the sera of RA patients and controls

4 RA患者血清蛋白標(biāo)志物的篩選及診斷模型的建立

將統(tǒng)計分析得到的33個差異蛋白峰導(dǎo)入Biomarker Patterns軟件，篩選診斷RA的最佳標(biāo)志物。結(jié)果顯示 m/z為 15715.5D、7771.4D、8959.4D、8469.8D和8710.8 D的5個蛋白質(zhì)為診斷RA的最佳標(biāo)志物，見圖3。這5個蛋白標(biāo)志物組成的診斷模型能很好地將RA患者區(qū)分出來，其診斷模型如圖4。經(jīng)統(tǒng)計分析，該模型在建模組中對RA的診斷敏感性為93.3%，特異性為95.1%。用試驗組對此模型進(jìn)行雙盲驗證后得到，其對RA診斷的敏感性為86.7%，特異性為90%，見表3。

表3 RA診斷模型的診斷特征及盲法驗證結(jié)果Table 3.The characteristics of the diagnostic model and the results of blind test for RA

討 論

RA是一種致殘性很高的疾病。由于其病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明，早期臨床表現(xiàn)不典型，而且缺乏較好的診斷指標(biāo)，給疾病早期診斷和治療帶來了一定的困難。大量臨床觀察發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)病變在發(fā)病后第一年發(fā)展最快，發(fā)病2年后即可出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)損害［3］。所以，早期診斷和規(guī)范治療是防止關(guān)節(jié)畸形和致殘的關(guān)鍵。然而，目前尚沒有一種檢測指標(biāo)同時兼具高敏感性和特異性。因此，探索和建立一種簡單、快速、敏感性高和特異性強(qiáng)的RA早期診斷技術(shù)已成為當(dāng)前亟待解決的問題。

近些年，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究得到了前所未有的發(fā)展，出現(xiàn)了許多蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，其中，迅速發(fā)展的生物質(zhì)譜為此提供了關(guān)鍵性技術(shù)手段［4］。目前，表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(surfaceassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)在探尋多種疾病特異性蛋白標(biāo)志物的研究中得到了廣泛認(rèn)可，它可以將檢測物點樣于相應(yīng)芯片上去捕獲目的蛋白，

Figure 3.Representative mapping of sera from healthy controls(C)，patients with OA，patients with RA.The x-axis represents m/z，and the y-axis represents the relative intensity.圖3 建立RA診斷模型的5個蛋白峰在RA、OA患者和健康體檢者(C)之間的圖譜

Figure 4.Diagram of a diagnostic model for 30 patients with RA，20 patients with OA and 21 healthy controls.The intensities of the selected peaks were submitted to Biomarker Pattern software as a‘root note’.Based on peak intensity，a threshold was determined by Biomarker Pattern software to classify the root node into two child nodes.If the peak intensity of a blind sample was lower than or equal to the threshold，this peak would be labeled as“l(fā)eft-side child node”.Peak intensity higher than the threshold would be marked as“right-side child node”.After rounds of decision making，the training set was found to be discriminatory with the least error.圖4 RA的診斷模型圖

然后上機(jī)直接讀?。?］。而 MALDI-TOF-MS則是借助磁珠的特性來獲取樣品目的蛋白，然后將蛋白結(jié)晶點樣于只起載體作用的芯片上，再上機(jī)讀取。與傳統(tǒng)的蛋白芯片相比，WCX納米磁性微球具有強(qiáng)大的表面積，它能夠更好地捕獲血清中的小分子多肽或蛋白，所以結(jié)合了WCX納米磁性微球的MALDI-TOF-MS技術(shù)可檢測到血清中更多低豐度蛋白質(zhì)［6］。作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的經(jīng)典技術(shù)，MALDI-TOF-MS具有樣品用量少、操作簡便、分辨力高、重復(fù)性好和敏感性高等優(yōu)點［7］。它利用激光脈沖輻射使芯片上的分析物解離成氣化離子，根據(jù)不同質(zhì)荷比及含量的多寡，這些離子在儀器電場中飛行的時間長短不一，可直觀地用位置、強(qiáng)弱不同的峰表現(xiàn)出來，由此繪制出1張質(zhì)譜圖用于后期分析［8］。MALDI-TOF-MS 技術(shù)在腫瘤［9，10］、心肌梗死［11］、以及自身免疫性疾?。?2-14］等研究中均有涉足，為疾病的早期診斷提供了重要幫助。

本研究通過WCX納米磁性微球結(jié)合MALDITOF-MS技術(shù)，對60例RA患者、35例OA患者及36名健康體檢者進(jìn)行血清蛋白質(zhì)譜分析。Ciphergen ProteinChip和BioMarker Wizard軟件初步篩檢結(jié)果顯示，與對照組(OA患者和健康體檢者)相比，RA組共存在33個差異蛋白。其中，13個蛋白質(zhì)在RA組中高表達(dá)，20個低表達(dá)。這些均提示通過本實驗的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，可以在RA患者中找到一些區(qū)別于OA患者和健康體檢者的蛋白質(zhì)。而且從差異蛋白質(zhì)的數(shù)量上和表達(dá)程度上來看，參與RA發(fā)病機(jī)制的免疫反應(yīng)蛋白較多，免疫介導(dǎo)反應(yīng)過程復(fù)雜，這也可能是至今還未能闡明RA發(fā)病機(jī)制的原因之一。對33個差異蛋白進(jìn)一步經(jīng)Biomarker Patterns軟件分析，得到5個最佳潛在血清蛋白標(biāo)志物，它們的m/z分別為 15715.5D、7771.4D、8959.4D、8469.8D 和8710.8 D。這5個標(biāo)志物構(gòu)建的診斷模型可以分別將RA患者與OA患者和健康體檢者很好的區(qū)分開。60例標(biāo)本盲法驗證結(jié)果顯示其敏感性為86.7%，特異性為90.0%。這說明在RA發(fā)病過程中這5種蛋白質(zhì)發(fā)生了特征性變化，它們之間的聯(lián)合和/或相互的變化可能與RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對提高RA的確診率具有重要的意義。而且該模型對RA診斷的敏感性、特異性均較高，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)自身抗體不能兼顧“雙高”的缺點。

MALDI-TOF-MS結(jié)合WCX納米磁性微球技術(shù)將會對RA的早期診斷、早期治療等方面具有一定的價值。它可以快速、有效地檢測到與RA相關(guān)的特異性蛋白標(biāo)志物，并構(gòu)建出敏感性、特異性均較高的診斷模型，為臨床上RA診斷提供了良好的前景。

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