王達(dá)安， 龔小衛(wèi)， 劉愛華， 梅柱中， 王 丹， 明小燕， 王 旭，魏 潔， 鄧 鵬， 姜 勇△

(1南方醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室和廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3南方醫(yī)院呼吸科，廣東 廣州 510515;2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，廣東 廣州 510632)

p38調(diào)節(jié)活化蛋白激酶(p38 regulated/activated protein kinase，PRAK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，人PRAK由471個(gè)氨基酸組成，分子量約54 kD，存在于人的多種組織及細(xì)胞中。早期有關(guān)PRAK功能的研究主要集中在介導(dǎo)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase，p38MAPK)通路的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過程［1，2］，近年發(fā)現(xiàn)PRAK可能還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞衰老過程［3，4］，并在細(xì)胞周期的有絲分裂調(diào)控中發(fā)揮重要作用［5］。然而，PRAK在介導(dǎo)各種生理和病理過程中的確切功能及其調(diào)控的分子機(jī)制仍未完全清楚;為此，我們構(gòu)建了PRAK與串聯(lián)親和純化(tandem affinity purification，TAP)標(biāo)簽融合表達(dá)的載體，并建立其在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，為利用TAP系統(tǒng)進(jìn)一步研究PRAK在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的作用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 主要儀器

臺(tái)式微量離心機(jī)和臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Beckman);PCR儀(Biometra);Mini VE垂直電泳系統(tǒng)、水平電泳儀和半干電轉(zhuǎn)儀(Amersham Pharmacia Biotech);凝膠成像系統(tǒng)(Vilber Lourmat);CO2培養(yǎng)箱(Heraeus);熒光顯微鏡(Leica);IS2000R多功能影像系統(tǒng)(Kodak)。

2 主要試劑

DNA ladder、質(zhì)粒小量制備試劑盒和凝膠回收試劑盒(Axygen);限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/HindⅢ、高保真DNA聚合酶Pyrobest和T4 DNA連接酶(TaKa-Ra);脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑PolyFect 2000(Qiagen);無血清培養(yǎng)基Opti－MEM(Gibco－BRL);DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone);G418(Sigma);兔抗鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽(calmodulin binding peptide，CBP)單克隆抗體(Millipore);辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG(Cell Signaling Technology);Alexa Fluor 488偶聯(lián)的抗兔IgG(Molecular Probes);其它試劑均為國產(chǎn)分析純;引物合成由Invitrogen公司完成。

3 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株

串聯(lián)親和純化載體 pNTAP(stratagene);質(zhì)粒pcDNA3.1－HA－PRAK、大腸桿菌菌株 DH5α和HEK293細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存。

4 pNTAP－PRAK重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)GenBank中的人PRAK編碼序列(序列號(hào)AF032437)設(shè)計(jì)PCR引物，其中在上游引物5'端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物5'端引入HindⅢ酶切位點(diǎn)。上游引物5'－TAGGATCCTCGGAGGAGAGCGACATGGAC －3'，下游引物 5'－TCAAAGCTTTTATTGGGATTCGTGGGACGTG－3'。以 pcDNA3.1－HAPRAK質(zhì)粒為模板，用高保真度DNA聚合酶Pyrobest進(jìn)行PCR擴(kuò)增帶酶切位點(diǎn)的目的片段PRAK，擴(kuò)增片段的大小為1.4 kb。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1min，共35個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，隨后用T4 DNA連接酶將其與BamHⅠ/HindⅢ雙酶切并電泳切膠回收的pNTAP進(jìn)行16℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種至含卡那霉素(Kan+)的LB瓊脂糖培養(yǎng)板上培養(yǎng)，挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基(Kan+)中，37℃振搖過夜。取菌液用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR及BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，并最終經(jīng)DNA序列分析進(jìn)行驗(yàn)證。構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pNTAP－PRAK。

5 基因轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的篩選

將HEK293細(xì)胞接種至60 mm培養(yǎng)皿中，用含5%FBS的DMEM，于5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)至約70%融合度時(shí)，采用PolyFect使用說明書介紹的方法將pNTAP－PRAK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，以4000 mg/L G418篩選30 d，獲得具有G418抗性的陽性細(xì)胞克隆，再用有限稀釋法作單細(xì)胞化克隆篩選，擴(kuò)增培養(yǎng)后經(jīng)Western blotting及細(xì)胞免疫熒光鑒定為陽性的細(xì)胞克隆即為穩(wěn)定表達(dá)TAP tagged－PRAK的 HEK293細(xì)胞系，命名為HEK293－TAP tag－PRAK細(xì)胞;以未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞作篩選的空白對(duì)照。

6 Western blotting免疫印跡分析法

收集G418篩選后的HEK293－TAP tag－PRAK細(xì)胞，裂解后取20 μL處理后的蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳(5%濃縮膠，恒壓80 V 30 min;12%分離膠，恒壓120 V 2 h)，電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上(恒流80 mA 1 h)，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉 3 h，與1∶8000稀釋后的Ⅰ抗(兔抗CBP抗體)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，然后與1∶6000稀釋后的Ⅱ抗(HRP標(biāo)記的抗兔IgG)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白表達(dá)情況。以野生型HEK293細(xì)胞裂解樣品作陰性對(duì)照，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pNTAP－PRAK質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞裂解樣品為陽性對(duì)照。

7 細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記法

將HEK293－TAP tag－PRAK細(xì)胞接種至Petri皿，用含5%FBS的DMEM，于5%CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)液，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗1次，用含0.1%Triton X－100的PBS(PBST)透化細(xì)胞膜5 min，PBS洗3次，0.1%硼氫化鈉處理細(xì)胞5 min，PBST洗1次，3%BSA封閉2 h，PBST洗1次，加入按1∶800稀釋的Ⅰ抗(兔抗CBP抗體)，4℃孵育過夜，PBST洗3次，加入按1∶500稀釋的Ⅱ抗(Alexa Fluor 488偶聯(lián)的抗兔IgG)，室溫孵育2 h，PBST洗3次，DAPI染核5 min后封片，用Leica熒光顯微鏡的L5和A4濾光片觀察上述重組載體在細(xì)胞中的表達(dá)和定位情況，并進(jìn)行圖像采集;以野生型HEK293細(xì)胞作陰性對(duì)照。

結(jié) 果

1 PRAK片段的擴(kuò)增

將利用pcDNA3.1－HA－PRAK作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見在約1.4 kb處有1條帶，見圖1，與預(yù)計(jì)的目的片段大小位置相符。

Figure 1.PRAK amplified by PCR.Lane 1:DNA marker;Lane 2:PCR product.圖1 PRAK的PCR擴(kuò)增

2 重組質(zhì)粒的鑒定

pNTAP－PRAK重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物及BamHⅠ/HindⅢ雙酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見約1.4 kb和4.5 kb大小的片段，與預(yù)計(jì)大小相符，見圖2。DNA測序結(jié)果顯示與人的PRAK開放閱讀框序列一致。

Figure 2.Identification of recombinant plasmid pNTAP－PRAK.Lane 1:DNA marker;Lane 2:PCR product;Lane 3:product digested by restriction endonuclease.圖2 重組質(zhì)粒pNTAP－PRAK的鑒定

3 Western blotting結(jié)果

檢測結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pNTAP－PRAK質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞樣品和HEK293－TAP tag－PRAK細(xì)胞系樣品對(duì)應(yīng)泳道均可見在約62 kD(PRAK+TAP tag)處有明顯的免疫雜交條帶，但HEK293－TAP tag－PRAK細(xì)胞系的條帶明顯弱于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pNTAPPRAK質(zhì)粒的 HEK293細(xì)胞，見圖 3;而野生型HEK293細(xì)胞樣品對(duì)應(yīng)泳道未見陽性條帶。

Figure 3.Expression of fusion protein TAP tagged－PRAK in cells detected by Western blotting.Lane 1:HEK293 cells(wild type);Lane 2:HEK293 cells transientlytransfected with plasmid pNTAP－PRAK;Lane 3:HEK293－TAP tag－PRAK cell line.圖3 Western blotting檢測TAP tagged－PRAK的表達(dá)

4 細(xì)胞免疫熒光檢測結(jié)果

HEK293－TAP tag－PRAK細(xì)胞的免疫熒光檢測結(jié)果顯示TAP tag－PRAK融合蛋白在所有細(xì)胞中均有表達(dá)，且融合蛋白主要分布在細(xì)胞核中;而野生型HEK293細(xì)胞內(nèi)未檢測到標(biāo)記的蛋白綠色熒光信號(hào)，見圖4。

Figure 4.Expression and localization of fusion protein TAP tagged－PRAK in HEK293－TAP tag－PRAK cell line(immunofluorescence assay，×400).1:fusion protein TAP tagged－PRAK labelled with Alexa Fluor 488;2:nucleus stained with DAPI dye.圖4 TAP tagged－PRAK融合蛋白在HEK293－TAP tag－PRAK細(xì)胞系中的表達(dá)和定位

討 論

PRAK又稱MAPK激活的蛋白激酶5(MAPK－activated protein kinase 5，MAPKAPK5/MK5)，是1998年作為p38MAPK的下游底物被克隆和鑒定出來的，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶;人PRAK由471個(gè)氨基酸組成，分子量約54 kD;PRAK在人的心、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎和胰腺等多種組織以及 HEK293、A549、HeLa、HepG2 和 Jurkat等細(xì)胞中均有表達(dá)［2］。在靜息狀態(tài)下，內(nèi)源性PRAK主要分布于細(xì)胞質(zhì)，而外源性PRAK則主要分布于細(xì)胞核內(nèi)。實(shí)驗(yàn)顯示，PRAK存在核－質(zhì)穿梭功能;在受刺激時(shí)，PRAK入核減少，而出核增多，因而更多的PRAK分布在細(xì)胞質(zhì)中［6］。PRAK是MAPK激活的蛋白激酶家族中相對(duì)較新的1個(gè)成員，相關(guān)研究報(bào)道不多;其激活途徑、激活方式、下游底物、介導(dǎo)的功能以及核－質(zhì)移位與功能之間的關(guān)系等至今尚未完全清楚。

現(xiàn)有的PRAK激活途徑和功能研究報(bào)道主要集中在與p38MAPK和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular－signal regulated protein kinase，ERK)成員ERK3/4之間的相互關(guān)系方面。早期的研究報(bào)道顯示 PRAK 可受 p38MAPK 通路調(diào)控;研究發(fā)現(xiàn)［2，4］，細(xì)胞在應(yīng)激和致炎細(xì)胞因子的刺激下，PRAK的Thr182能夠被p38MAPKα和p38MAPKβ磷酸化而激活，繼而磷酸化并激活熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)，從而介導(dǎo)細(xì)胞骨架重構(gòu)，參與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng);而且p38MAPKα和p38MAPKβ引起的PRAK磷酸化還可導(dǎo)致PRAK的核－質(zhì)移位［5］，但PRAK的移位與其介導(dǎo)的功能有何關(guān)系至今未見相關(guān)報(bào)道。有研究者認(rèn)為癌基因ras的表達(dá)產(chǎn)物Ras能通過p38MAPK通路激活PRAK，而PRAK反過來負(fù)反饋地抑制Ras介導(dǎo)的細(xì)胞增殖［3］。另外，最近也有研究顯示，PRAK可能參與癌基因產(chǎn)物Ras誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老過程，此過程也可能涉及p38MAPK通路;即Ras通過某種方式激活p38MAPK通路，后者引起PRAK的磷酸化、激活，激活的PRAK再磷酸化、激活p53，從而促進(jìn)細(xì)胞衰老，此過程還與抑制細(xì)胞惡變有關(guān)［4］。但 Shi等［7］對(duì) PRAK 受 p38MAPK 通路調(diào)控的觀點(diǎn)提供了質(zhì)疑，他們的研究結(jié)果顯示，雖然過表達(dá)的p38MAPK能磷酸化PRAK，但生理表達(dá)水平的p38MAPK并不能顯著增加PRAK活性，而且生理表達(dá)水平的PRAK也不能有效地激活HSP27。因此，PRAK與p38MAPK通路的關(guān)系還需進(jìn)一步驗(yàn)證。另一研究較多的PRAK調(diào)控因素是ERK3/4;有研究顯示［8，9］，MAKP 通路中的非典型成員 ERK3和ERK4可直接磷酸化、激活PRAK，并引起PRAK核－質(zhì)移位，推測PRAK可能參與ERK3和ERK4介導(dǎo)的胚胎發(fā)育的調(diào)控過程;但PRAK激活后通過何種底物發(fā)揮此作用至今尚不清楚。除了p38MAPK和ERK3/4可能參與PRAK的調(diào)控外，本實(shí)驗(yàn)室最近的研究提示PRAK和雙泛素(diubiquitin)的相互作用也可能在細(xì)胞周期的有絲分裂調(diào)控中發(fā)揮重要作用;研究結(jié)果表明，PRAK可拮抗diubiquitin介導(dǎo)的細(xì)胞染色體不穩(wěn)定和多形核的出現(xiàn);但該研究未能得到PRAK和diubiquitin在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的直接證據(jù)［5］;而且，是什么因素調(diào)節(jié)、介導(dǎo)它們的相互作用也有待進(jìn)一步研究闡明。綜上所述，PRAK可能參與多種細(xì)胞功能的調(diào)控過程，但目前對(duì)PRAK的功能及其作用機(jī)制認(rèn)識(shí)還非常有限，已有的研究結(jié)果也存在一些需要進(jìn)一步驗(yàn)證的地方;此外，PRAK是否還有其它未發(fā)現(xiàn)的激活調(diào)控途徑以及其它功能?這些問題都需要進(jìn)一步探討。

TAP技術(shù)是1999年由Rigaut等［10］建立起來的一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用的新方法。TAP技術(shù)的核心是:應(yīng)用分子克隆方法將所研究的蛋白質(zhì)復(fù)合體中一已知蛋白質(zhì)組分(誘餌蛋白)克隆到帶有2個(gè)不同的親和純化標(biāo)簽的表達(dá)載體上，我們構(gòu)建的TAP融合載體帶有鏈親和素結(jié)合多肽(streptavidin binding peptide，SBP)和鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽(calmodulin binding peptide，CBP)2種親和純化標(biāo)簽，在親和純化標(biāo)簽與誘餌蛋白構(gòu)成的融合蛋白表達(dá)后，經(jīng)過連續(xù)二步的親和純化，在生理?xiàng)l件下將誘餌蛋白及其相互作用的蛋白質(zhì)以蛋白質(zhì)復(fù)合體的形式純化出來，再利用生物質(zhì)譜等下游技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合體的組分進(jìn)行鑒定，從而闡明蛋白質(zhì)相互作用的分子機(jī)制。該蛋白質(zhì)復(fù)合體純化策略既能保證目的蛋白的高效回收，又能保證目的蛋白的純度，TAP的應(yīng)用使蛋白質(zhì)相互作用的研究在方法學(xué)上獲得了重大進(jìn)步。為進(jìn)一步從蛋白質(zhì)相互作用的角度探討PRAK的生物學(xué)功能，我們把PRAK克隆到N端的TAP載體上，并觀察其在 HEK293細(xì)胞中的表達(dá)情況。Western blotting結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pNTAP－PRAK質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞樣品和HEK293－TAP tag－PRAK細(xì)胞系樣品均可見分子量與PRAK+TAP tag大小相符的免疫雜交條帶，說明該重組質(zhì)粒能在HEK293細(xì)胞中有效表達(dá)，且PRAK與TAP tag的融合并沒有影響兩者的表達(dá)，也沒有影響TAP tag中CBP的抗原性。此外，為減少因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)外源性基因高表達(dá)所引起的蛋白質(zhì)非特異性相互作用對(duì)將來TAP鑒定結(jié)果的影響，我們利用融合載體上的新霉素抗性，對(duì)轉(zhuǎn)染pNTAP－PRAK重組質(zhì)粒后的HEK293細(xì)胞進(jìn)行了G418篩選，建立起穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系;Western blotting鑒定結(jié)果顯示HEK293－TAP tag－PRAK細(xì)胞系的條帶明顯弱于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pNTAP－PRAK質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，表明HEK293－TAP tag－PRAK細(xì)胞系能低水平穩(wěn)定表達(dá)TAP tagged－PRAK，有效避免了外源性基因的過高表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示融合蛋白主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，這與既往有關(guān)外源性PRAK的細(xì)胞定位研究結(jié)果一致［6］，說明 PRAK與 TAP tag的融合并沒有影響到外源性PRAK的細(xì)胞定位。以上工作為利用TAP系統(tǒng)進(jìn)一步深入研究PRAK的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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