楊 婷， 謝汝佳， 羅新華， 楊 勤△

(1貴陽醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，2貴州省人民醫(yī)院傳染科，貴州 貴陽 550004)

肝星狀細(xì)胞的激活以及大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝臟內(nèi)的沉積是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)［1，2］。目前的研究表明，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)增生與合成膠原等細(xì)胞外基質(zhì)主要由細(xì)胞因子所介導(dǎo)。在眾多的細(xì)胞因子中，轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)與HSCs的活化有密切的關(guān)系，是目前公認(rèn)的致纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一［3］。TGF－β的生物學(xué)效應(yīng)非常廣泛復(fù)雜，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程主要依賴于其下游的一族高度保守的胞內(nèi)信號蛋白－Sma和Mad的基因表達(dá)產(chǎn)物(sma and mothers against Dpp，Smad)蛋白家族來完成［4］。采取藥物干預(yù)TGF－β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程及其關(guān)鍵性信號分子表達(dá)的研究已成為近年來抗纖維化研究的一個熱點(diǎn)。本研究以大鼠肝纖維化模型為研究對象，觀察了丹芍化纖膠囊對大鼠肝組織中Smad2/3、Smad4和Smad7表達(dá)的影響，以探討肝纖維化發(fā)生的機(jī)制以及丹芍化纖膠囊治療肝纖維化可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物及分組 雄性Wistar大鼠48只，清潔級，體重180－220 g，貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物隨機(jī)分成3組:正常對照組(normal control group)16只，CCl4肝纖維化模型組(hepatic fibrosis，HF group)16只，丹芍化纖膠囊治療組(Dan－Shao－Hua－Xian，DSHX therapy group)16只。

1.2 藥品和主要試劑 丹芍化纖膠囊(由漢防己甲素、丹參、赤芍、黃芪、銀杏葉組成)，貴陽制藥廠生產(chǎn)，棕黃色細(xì)顆粒膠囊制劑，臨用前取膠囊內(nèi)容物研磨成粉末，用蒸餾水稀釋至所需濃度。四氯化碳(CCl4，重慶無機(jī)化學(xué)試劑廠生產(chǎn))。Anti－actin(Calbiocam)，mouse anti－ Smad2/3(BD Biosciences)，mouse anti－ Smad4、goat anti－ Smad7(Santa Cruz)、rabbit anti－Smad7(武漢博士德公司)。RTPCR所需的引物由Primer Express軟件(Biosystems)設(shè)計，RT－PCR所需的試劑、96孔板(Bio－Rad)、SyBR green(Applied Biosystems)及預(yù)染蛋白marker由美國衛(wèi)生院癌癥/環(huán)境衛(wèi)生研究所劉杰博士惠贈。Trizol試劑購自 Invitrogen。Qiagen RNeasy mini kit(Qiagen)。免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司。

2 模型復(fù)制

除正常組外，其余各組用復(fù)合病因刺激制備大鼠肝纖維化模型:皮下注射40%CCl4花生油溶液3 mL/kg(首次用純CCl40.5 mL/kg)，每周2次，共8周;同時喂予高脂低蛋白飼料(79.5%玉米粉，20%豬油，0.5%膽固醇)，間日以30%乙醇為飲料。正常組給予正常飲食。造模結(jié)束后CCl4肝纖維化組大鼠股動脈放血處死，留取血液及全部肝臟。剩余大鼠除正常組外，其余治療組每天給予丹芍化纖膠囊灌胃1次，給藥量為1 g/kg BW(相當(dāng)于臨床用藥量的16倍)，觀察8周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時股動脈放血處死全部動物(此時正常組存活16只大鼠，肝纖維化模型組還存活12只大鼠，治療組存活10只大鼠，其余死亡)。

3 觀察指標(biāo)

3.1 生化測定 分別于造模結(jié)束和治療8周后，留取尿液、血液、肝臟標(biāo)本，測量以下指標(biāo):(1)肝臟指數(shù):計算方法為(肝臟重量/體重)×100%;(2)透明質(zhì)酸(hexadecenoic acid，HA)按試劑盒說明用放射免疫法測定;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)由日立7170A全自動生化分析儀測定;(3)尿羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)排出量檢測:將CCl4肝纖維化模型組、剩余各組大鼠置于代謝籠內(nèi)，收集24 h尿液，嚴(yán)格按試劑盒說明操作。

3.2 肝臟纖維化程度 動物處死后，立即解剖，取相同部位1 cm×1 cm×0.5 cm大小肝葉浸于10%中性甲醛緩沖液中固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋切片行HE和van Gieson(VG)染色。光鏡下觀察肝臟病理變化并參照王寶恩等［1］肝纖維化分級法進(jìn)行膠原纖維增生程度半定量分析。

3.3 Smad2/3、Smad4和Smad7免疫組化染色 采用免疫組化方法，Ⅰ抗為mouse anti－Smad2/3 HRP(1∶100);rabbit anti－ Smad4(1∶50);goat anti－Smad7 HRP(1∶70)，4℃過夜。次晨用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate－buffered solution，PBS)沖洗，滴加相應(yīng)的Ⅱ抗，按SABC免疫組化試劑盒說明書操作，3，3'－二氨基聯(lián)苯胺(3，3'－ diaminobenzidine，DAB)顯色，陽性表達(dá)處為棕黃色;同時，以PBS替代Ⅰ抗作空白對照，結(jié)果為陰性。每張切片隨機(jī)選取5個400倍視野，計算各組顯微鏡下每400倍視野的陽性細(xì)胞百分率。

3.4 Smad2/3、Smad4和Smad7實(shí)時熒光定量 PCR(qRT－PCR) 用Trizol試劑提取大鼠肝組織總RNA，隨后按Qiagen RNeasy mini kit試劑盒說明書對RNA進(jìn)行純化。用紫外分光光度計測定RNA純度和含量。將1 μg純化RNA加入RT反應(yīng)體系中(總體積 20 μL)，按 25 ℃ 10 min，48 ℃ 60 min，95 ℃5 min的反應(yīng)條件反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA樣品5.0 μL加入 real－time PCR反應(yīng)體系(總體積25 μL)，于96孔板上加樣，按照 50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)。結(jié)果以normal/actin的比值進(jìn)行t檢驗(yàn)。

3.5 Smad2/3、Smad4 和 Smad7 免疫印跡(Western blotting) 每組大鼠各切取0.2 g肝臟組織加入1 mL細(xì)胞裂解液勻漿提取大鼠肝臟總蛋白，蛋白定量后每組上樣150 μg，進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。Ⅰ抗以1∶100稀釋，Ⅱ抗以1∶500稀釋，孵育PVDF膜，用 Smad2/3和 Smad4用 DAB顯色，Smad7用BCIP/NBT solution 10 mL顯色，室溫水平搖床振搖直至目的位置處出現(xiàn)清晰的條帶，即用ddH2O漂洗以終止顯色。用Bio－Rad凝膠成像分析系統(tǒng)的Quantity One軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，計量以平均吸光密度×面積來表示。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 丹芍化纖膠囊對大鼠肝臟指數(shù)、血清HA、ALT的影響

與正常組比較，CCl4肝纖維化模型組大鼠肝臟指數(shù)、血清 HA、ALT、尿 Hyp均顯著增加(P＜0.01或P＜0.05);丹芍化纖膠囊治療組大鼠肝臟指數(shù)、血清HA、ALT均顯著低于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，提示治療組肝腫大有所減輕;尿Hyp排出量較模型組顯著增加(P＜0.01)，說明用藥后膠原降解、排出量明顯增加，見表1。

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)、血清HA、ALT的測定Table 1.The liver index，serum HA and ALT，urinary excretion of Hyp in rats()

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)、血清HA、ALT的測定Table 1.The liver index，serum HA and ALT，urinary excretion of Hyp in rats()

△P ＜0.05，△△P ＜ 0.01 vs control group;*P ＜ 0.05，＊＊P ＜0.01 vs HF group.Control:normal control group;HF:hepatic fibrosis model group;T:Dan－shao－h(huán)ua－xian treatment group.

Control 16 0.025 ±0.003 192.52 ±41.97 32.40 ±2.30 47.80 ±5.76 HF 12 0.042 ±0.011△△316.17 ±78.48△174.50 ±6.02△△ 62.00 ±6.40△△T 10 0.027 ±0.002＊＊200.78 ±31.71*93.13 ±5.79＊＊541.09 ±73.39＊＊

2 丹芍化纖膠囊對大鼠肝臟纖維化程度的影響

經(jīng)HE和VG染色，光鏡下觀察顯示:正常組大鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，無膠原纖維增生;肝纖維化模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生，內(nèi)有較多炎性細(xì)胞浸潤，同時，膠原纖維向肝實(shí)質(zhì)延伸，形成纖維間隔，包繞、分割正常肝組織，形成假小葉，纖維化程度較正常組顯著增加，P＜0.01;丹芍化纖膠囊治療組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)改善明顯，匯管區(qū)結(jié)締組織增生顯著減少，纖維間隔顯著變薄、減少，與模型組比較差異顯著。各組大鼠肝纖維化程度分級具體情況見表2。

表2 各組大鼠肝纖維化程度分級Table 2.The degree of hepatic fibrosis in rats

3 免疫組化SABC法檢測丹芍化纖膠囊對大鼠Smad2/3、Smad4及Smad7表達(dá)的影響

3.1 免疫組化SABC法檢測丹芍化纖對大鼠肝臟Smad2/3、Smad4表達(dá)的影響 結(jié)果顯示正常組Smad2/3和Smad4的表達(dá)較少，少數(shù)肝細(xì)胞胞漿有散在分布。肝纖維化模型組Smad2/3、Smad4成圓形粗顆粒狀分布于肝細(xì)胞胞漿中，也有少數(shù)分布于結(jié)締組織中，呈棕黃色。極少數(shù)細(xì)胞核內(nèi)也可見Smad2/3及Smad4的表達(dá)，見圖1。Smad2/3的表達(dá)陽性率顯著高于正常組(P＜0.01);丹芍化纖治療組Smad2/3、Smad4的表達(dá)均明顯減少，兩者的陽性表達(dá)面積百分比均較肝纖維化組顯著降低(P＜0.01)，見表3。

3.2 免疫組化SABC法檢測丹芍化纖膠囊對大鼠Smad7表達(dá)的影響 結(jié)果顯示正常組Smad7主要呈細(xì)顆粒狀，廣泛均勻地分布于肝細(xì)胞胞漿中，量多，色棕黃;肝纖維化模型組Smad7表達(dá)呈棕黃色，分布于疏松化的肝細(xì)胞胞漿中，少部分位于纖維間隔中，其表達(dá)陽性率顯著少于正常組(P＜0.01)，見圖1;而丹芍化纖治療組Smad7表達(dá)染色較淡，其陽性表達(dá)面積百分比較肝纖維化組顯著增高(P＜0.01)，見表3。

Figure 1.Immunohistochemistry staining showed the expression of Smad2/3，Smad4 and Smad7 in hepatic tissues(×200).圖1 免疫組化染色顯示肝組織中Smad2/3、Smad和Smad7的表達(dá)

表3 各組大鼠肝臟Smad2/3、Smad4、Smad7陽性表達(dá)面積百分比Table 3.The percentages of the expression of Smad7 in rat livers from various group()

表3 各組大鼠肝臟Smad2/3、Smad4、Smad7陽性表達(dá)面積百分比Table 3.The percentages of the expression of Smad7 in rat livers from various group()

△△P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs HF group.

Control16 0.82 ±0.36 1.20 ±0.48 12.80 ±2.32 HF 12 2.16 ±0.38△△ 2.45 ±0.36△△ 0.98 ±0.20△△T 10 0.81 ±0.29* 1.15 ±0.45＊＊ 3.18 ±0.72＊＊

4 Western blotting法檢測丹芍化纖膠囊對大鼠肝臟 Smad2/3、Smad4、Smad7 表達(dá)的影響

4.1 Western blotting法檢測丹芍化纖膠囊對大鼠Smad2/3表達(dá)的影響 以β－actin作為內(nèi)參照，在56 kD附近可清楚地檢測到相比鄰的2組Smad2/3特異性免疫印跡條帶，見圖2。肝纖維化模型組Smad2/3的蛋白條帶深于正常對照組;治療組的Smad2/3的蛋白條帶較肝纖維化模型組變淺，且接近正常水平。

4.2 Western blotting法檢測丹芍化纖膠囊對大鼠Smad4表達(dá)的影響 以β－actin作為內(nèi)參照，在66 kD附近可清楚地檢測到特異性免疫印跡條帶3條，見圖2。與正常組比較，肝纖維化模型組Smad4的蛋白表達(dá)輕度增加;予以丹芍化纖治療后，其表達(dá)有所下降。

4.3 Western blotting法檢測丹芍化纖膠囊對大鼠Smad7表達(dá)的影響 以β－actin作為內(nèi)參照，在51 kD處檢測到Smad7特異性免疫印跡條帶，見圖2。肝纖維化模型組Smad7的蛋白條帶明顯淺于正常對照組，灰度分析較正常組顯著降低了7倍;予以丹芍化纖治療后，條帶較模型組明顯加深，灰度分析顯示其表達(dá)量較肝纖維化模型組增加3倍。

5 丹芍化纖對大鼠肝組織 Smad2/3、Smad4、Smad7mRNA表達(dá)的影響

經(jīng)qRT－PCR方法檢測大鼠肝組織中Smad2/3、Smad4、Smad7mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常組比較，肝纖維化模型組的Smad2/3、Smad4mRNA明顯增高(P＜0.01);Smad7顯著降低(P ＜0.05)。與肝纖維化模型組比較，丹芍化纖治療組大鼠肝組織中Smad7 mRNA的表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，接近正常水平，Smad2/3、Smad4mRNA的表達(dá)輕度下降，但無顯著差異，見圖3。

Figure 2.Smad2/3，Smad4，Smad7 levels detected by Western blotting.A:β － actin;B:Smad2/3;C:Smad4;D:Smad7;N:normal control group;HF:hepatic fibrosis model group;T:Dan－shao－h(huán)ua－xian treatment group.E:.n=8.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs control group;*P ＜0.05 vs HF group.圖2 蛋白免疫印跡法檢測Smad2/3、Smad4、Smad7

Figure 3.The expression of Smad2/3，Smad4，Smad7 mRNA in rat livers from various groups..n=8.△P＜0.05，△△ P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05 vs HF group.圖3 各組大鼠肝臟中Smad2/3、Smad4、Smad7 mRNA的表達(dá)量

討 論

TGF－β/Smad信號通路在纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用已引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能，Smads蛋白分為 3 個亞家族［2－4］:(1)受體激活型Smad(receptor activated Smad，R －Smads)，主要包括Smad2、Smad3;(2)共同通路型Smad(common mediator Smad，Co－Smad)，包括Smad4;(3)抑制型 Smad(inhibitory Smad，I－Smads)，包括 Smad6和 Smad7。

近年來，國外學(xué)者正著力于對Smads分子基因表達(dá)調(diào)控的研究［3－6］，國內(nèi)學(xué)者則著力于探索藥物干預(yù)對Smads分子表達(dá)的影響［7－13］。然而對TGF－β/Smad信號通路中的關(guān)鍵靶蛋白的研究尚處于探索階段，許多問題尚待闡明。據(jù)此，我們觀察了TGF－β的主要下游信號蛋白Smad2/3、Smad4和Smad7在肝纖維化大鼠肝臟的表達(dá)狀況并探索了丹芍化纖膠囊對肝纖維化大鼠肝組織Smads的不同亞型表達(dá)的影響。

結(jié)果顯示，Smad2/3與Smad4在肝纖維化大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)陽性表達(dá)的形式極為相似，均從正常的彌散分布狀態(tài)演變?yōu)榫奂拇诸w粒狀，這種形態(tài)學(xué)變化與現(xiàn)階段對Smad2，3、Smad4參與纖維化需要形成聚集復(fù)合物的研究理論相一致。另外，多角度的檢測揭示Smad2/3、Smad4的蛋白及mRNA的表達(dá)在肝纖維化模型組均明顯增高，同時，抑制性Smad7的蛋白及mRNA的表達(dá)均顯著降低。這些Smad亞型在肝纖維化肝臟中的表達(dá)變化趨勢與國內(nèi)一些學(xué)者的研究結(jié)果類似，提示了在大鼠肝纖維化的進(jìn)程中，Smad2/3、Smad4和Smad7的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均發(fā)生改變，TGF－β/Smad信號通路的活化參與了大鼠CCl4誘導(dǎo)性肝纖維化的發(fā)生可能是其發(fā)病機(jī)制之一。

丹芍化纖膠囊是根據(jù)中醫(yī)活血化淤，通絡(luò)軟堅的理論及多年的臨床探索研制而成的中藥復(fù)方制劑，主要由丹參、赤芍、黃芪、銀杏葉等組成。肝纖維化大鼠在丹芍化纖膠囊治療8周后，肝臟指數(shù)降低，血清HA、ALT顯著下降，病理組織學(xué)檢查也發(fā)現(xiàn)肝纖維化程度明顯減輕。這些結(jié)果表明:丹芍化纖膠囊可改善肝功能，減輕肝纖維化程度，對肝纖維化的治療有一定的效果。另外，給予丹芍化纖膠囊治療的大鼠，Smad2/3、Smad4的蛋白表達(dá)水平明顯下降，但mRNA的表達(dá)與肝纖維化模型組比較幾乎沒有變化，而Smad7無論是蛋白的表達(dá)水平還是mRNA的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，這就提示了Smad7很可能是丹芍化纖膠囊作用的一個靶點(diǎn)。有研究表明，Smad7通過抑制TβRⅠ從而抑制TGF－β誘導(dǎo)的Smad2或Smad3磷酸化，Smad7水平在高于Smad3水平2倍時，便足以抑制TGF－β誘導(dǎo)的受體介導(dǎo)的Smad3磷酸化，由此我們推測丹芍化纖膠囊治療后Smad2/3的表達(dá)下調(diào)很可能是因?yàn)槭艿絊mad7的抑制。另外，治療組的Smad2/3、Smad4的陽性表達(dá)形式從粗顆粒狀又恢復(fù)為彌散分布狀態(tài)，似有顆粒解聚的傾向，據(jù)此，我們推測 Smad7的上調(diào)表達(dá)還能促進(jìn)Smad2/3、Smad4復(fù)合體顆粒的解聚。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明丹芍化纖膠囊對CCl4肝纖維化有明確的治療作用，其改善肝纖維化的作用機(jī)制與干預(yù)TGF－β/Smad信號通路有關(guān)，且可能更多是通過影響Smad7分子的轉(zhuǎn)錄與翻譯上調(diào)抑制性 Smad7的表達(dá)，從而加強(qiáng)對 Smad2/3、Smad4致纖維化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的反饋抑制來實(shí)現(xiàn)的。Smad7很可能是丹芍化纖的一個藥物作用靶點(diǎn)，有望成為抗肝纖維化藥物作用的一個靶標(biāo)及療效評價指標(biāo)。我們相信以Smad7作為抗纖維化的藥物作用靶點(diǎn)，深入探討Smad7的基因調(diào)控機(jī)制，可能為肝纖維化的防治提供一個新的頗有希望的干預(yù)途徑。

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