詹麗英, 李文瀾△, 柯 偉, 夏中元
(1武漢大學人民醫(yī)院麻醉科,湖北 武漢 430060;2湖北省中山醫(yī)院神經內科,湖北 武漢 430033)
內毒素存在于革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜中,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)為其主要成份。內毒素所致急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是臨床上常見的急危重綜合征,很多疾病可并發(fā)內毒素性ALI。ALI作為全身炎癥反應病理進程中的早期階段,常發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiartory distress syndrome,ARDS),是創(chuàng)傷、休克、外科感染等疾病致死的主要原因之一[1]。本研究將選用氣管內滴注內毒素急性肺損傷模型,探討在 ALI中p38MAPK、NF-κB與HO-1的相互關系,為臨床治療提供理論依據。
LPS、4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞磺?;交?-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑(SB203580,p38MAPK抑制劑,Sigma)、鋅原卟啉 IX(ZnPPIX,血紅素氧合酶 -1抑制劑,Sigma),血晶素(Hemin,血紅素氧合酶 -1誘導劑,Sigma),BCA檢測試劑盒(Pierce),兔抗大鼠MAPK(p38)抗體(BD),兔抗大鼠NF-κB(p65)抗體(NeoMarkers),anti-β-actin抗體(Santa Cruz),羊抗兔HRP-IgG(eBioscience)。
健康雄性Wistar大鼠40只,體重200-250 g,由武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。
2.1 實驗動物模型的制備及分組
實驗前禁食12 h,自由飲水。大鼠用7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉,仰臥固定消毒后逐層暴露氣管,動脈穿刺針(24號)經環(huán)甲膜向心端刺入氣管,LPS組用1 mL注射器抽取無菌生理鹽水配制的LPS溶液2.5 mg/kg連接穿刺針,回抽見空氣無阻力后將藥液緩慢滴入氣管中,拔出穿刺針,將大鼠直立旋轉,使藥液在肺內分布均勻,縫合切口后觀察。
動物分組:(1)對照組或生理鹽水組(NS組):氣管內給予等容積生理鹽水;(2)內毒素組(LPS組):氣管內滴注LPS 2.5 mg/kg;(3)血紅素氧合酶-1誘導劑血晶素+內毒素組(Hemin+LPS組):在氣管內滴注LPS前18 h腹腔注射Hemin 75 μmol/kg;(4)血紅素氧合酶-1抑制劑鋅原卟啉IX+內毒素組(Zn-PPIX+LPS組):在氣管內滴注LPS前18 h腹腔內注射ZnPPIX 40μmol/kg;(5)p38MAPK抑制劑SB203580+內毒素組(SB+LPS組):在氣管內滴注LPS前2 h SB203580以5 μmol/kg 2 h持續(xù)股靜脈泵入。
2.2 標本的采集及處理 LPS或NS滴注后6 h,頸動脈抽血2 mL,其中1 mL立即行血氣分析。之后頸動脈放血處死動物,開胸后結扎右側肺門,氣管切開,插入0.2 cm硅膠管,用4℃生理鹽水2 mL反復灌洗右肺2次,記錄灌洗液回收量,每次回收量無明顯差異,離心(3000 r/min)10 min,取上清液-70℃保存;測量右肺上葉濕/干重比;取右肺下葉肺組織行p38MAPK、NF-κB蛋白檢測;取右肺中葉行免疫組化染色和HE染色。
2.3 檢測指標及方法
①支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中性粒細胞(neutrophil)比 取BALF液沉淀,制細胞懸液少量于玻片,瑞氏-姬姆薩染色,油鏡下數200個細胞,得出多形核白細胞、分類計數,計算中性粒細胞百分比。
②BALF中蛋白含量 考馬斯亮藍蛋白測定法測BALF中蛋白含量。
③ 肺濕/干重比(wet/dry weight ratio,W/D) 取右肺上葉,濾紙吸干表面附著水分,用分析天平準確測量肺組織濕重,并記錄,于80℃恒溫箱烤72 h至肺干重恒定,稱其濕、干重,計算肺濕/干重(W/D)比值。
④動脈血氣(arterial blood gas,ABG) 按要求將血液填充到i-STAT手提式血氣分析儀配套的血氣分析測試片(i-STAT EG7+cartridge)加樣池中,避免氣泡產生,將標本插入自動血氣分析儀,讀取動脈氧分壓(arterial oxygen pressure,PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide in artery,PaCO2)和碳酸氫根(bicarbonate radical,HCO-3)值。⑤Western blotting法檢測肺組織p38MAPK、NF-κB蛋白表達 開胸取出右下肺組織,低溫保存,將肺組織標本用PBS洗滌2次后,加入裂解緩沖液,冰浴內勻漿,4℃ 12000 r/min離心30 min以除去組織碎片。取上清,用BCA檢測試劑盒檢測總蛋白濃度。取50 μg蛋白溶于2×SDS上樣緩沖液中,將樣本100℃煮沸5 min后,將上述各樣品經質量濃度10%SDS-PAGE凝膠,轉移至PVDF膜,用質量濃度5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h后,將 PVDF膜與Ⅰ抗(p38MAPK抗體,β-actin抗體)孵育,用TBST洗3次后將膜與HRP標記Ⅱ抗孵育1 h。TBST漂洗后,ECL顯色,X片曝光,照相。使用凝膠成像分析系統(tǒng)對顯色條帶進行吸光度分析。以樣本的平均吸光度除以相應內參照的平均吸光度,即為樣本蛋白的相對含量,然后將各樣本蛋白的相對含量間做統(tǒng)計分析圖。
⑥HO-1蛋白表達 開胸取出右肺中葉組織,體積分數10%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水石蠟包埋,制備3 μm厚的切片。SP法免疫組化染色按操作說明實施。陽性結果判斷:以肺組織切片細胞胞漿中出現棕黃色顆粒狀沉淀物為陽性細胞。將切片置Olympus顯微鏡(400倍)下,對所測視野進行準確定位,由攝像系統(tǒng)提取數值化細胞圖像,輸入HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(同濟千屏影像公司)進行處理,每標本隨機選取8個不重疊的視野,測定免疫組化陽性顆粒的平均光密度值,并計算8個視野吸光度值的均值,對HO-1蛋白表達做半定量分析。
⑦病理觀察 開胸取出右肺中葉0.5 cm×0.5 cm組織行光鏡觀察。
與NS組比較,LPS組、Hemin+LPS組、SB+LPS組、ZnPPIX+LPS組肺組織濕/干重明顯增加(P<0.05),中性粒細胞比、蛋白含量顯著增加(P<0.05或P<0.01);與LPS組比較,Hemin+LPS組、SB+LPS組肺組織濕/干重、中性粒細胞比、蛋白含量明顯減少(P<0.05),而ZnPPIX+LPS組顯著增加(P<0.05);Hemin+LPS組、SB+LPS組之間無顯著差異(P >0.05),見表1。表1 肺組織濕/干重比、支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞比及蛋白含量
Table 1.The ratio of neutrophils protein content of BALF and the ratio of W/D(.n=8)
Table 1.The ratio of neutrophils protein content of BALF and the ratio of W/D(.n=8)
△P<0.05,△△P <0.01 vs NS group;▲P <0.05 vs LPS group.
滴注LPS 6 h后,PaO2、PaCO2和HCO-3較NS組顯著下降(P<0.05)。Hemin+LPS組、SB+LPS組PaO2、PaCO2和HCO-3明顯高于LPS組,而ZnPPIX+LPS組明顯下降(P<0.05),Hemin+LPS組、SB+LPS組之間無顯著差異(P>0.05),見圖1。
Figure 1.Results of arterial blood gas analysis..n=8.△P<0.05 vs NS group;▲P<0.05 vs LPS group.圖1 動脈血氣結果
與NS組比較,LPS組、Hemin+LPS組、SB+LPS組、ZnPPIX+LPS組p38MAPK、NF-κB蛋白表達明顯增高(P<0.05);與LPS組比較,Hemin+LPS組、SB+LPS組的p38MAPK、NF-κB蛋白表達顯著降低(P <0.05),ZnPPIX+LPS組 p38MAPK、NF-κB蛋白表達明顯增高(P<0.05);Hemin+LPS組、SB+LPS組的p38MAPK、NF-κB蛋白表達無顯著差異(P >0.05),見圖2、3。
NS組HO-1免疫組化染色,基本未見陽性表達細胞;與NS組比較,LPS組肺組織HO-1強陽性表達(P<0.01),HO-1主要表達部位在支氣管、肺泡上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞,見圖4A-E;與LPS組相比,Hemin+LPS組、SB+LPS組HO-1的表達明顯升高(P<0.05),ZnPPIX+LPS組HO-1的表達明顯降低(P<0.05),Hemin+LPS組、SB+LPS組之間無顯著差異(P>0.05),見圖5。
Figure 2.Expression of p38MAPK in lung tissue..n=8.△P<0.05,△△P<0.01vs NS group;▲P <0.05 vs LPS group.圖2 肺組織中p38MAPK表達
Figure 3.Expression of NF-κB in lung tissue..n=8.△P<0.05,△△P <0.01 vs NS group;▲P <0.05 vs LPS group.圖3 肺組織中NF-κB的表達
Figure 4.HO -1 immunohistochemistry staining of lung tissue(×400).A:NS;B:LPS;C:Hemin+LPS;D:ZnPPIX+LPS;E:SB+LPS.圖4 大鼠肺組織HO-1免疫組化
Figure 5.Expression of HO-1 in lung tissue..n=8.△P<0.05,△△P <0.01vs NS group;▲P <0.05 vs LPS group.圖5 肺組織HO-1表達
(1)NS組:肺組織肺泡結構清晰,肺泡壁薄,未見出血水腫等明顯炎癥病理改變(HE×400)。(2)LPS組:肺泡腔變窄,肺泡壁增厚;肺間質充血、水腫、炎癥細胞浸潤,肺泡腔內可見粒細胞明顯增多,并見局部肺氣腫。(3)Hemin+LPS組:肺間隔炎癥細胞浸潤較LPS組明顯減輕,毛細血管增生不明顯。(4)ZnPPIX+LPS組:肺泡腔明顯變窄,肺間質明顯充血、水腫,大量炎癥細胞浸潤。(5)SB+LPS組:支氣管壁周圍稍有增厚,肺泡大小形態(tài)稍不規(guī)則,損傷程度亦明顯小于LPS組,見圖6A-E。
Figure 6.HE staining of lung tissue.A:NS;B:LPS;C:Hemin+LPS;D:ZnPPIX+LPS;E:SB+LPS.圖6 大鼠肺組織HE染色
ALI/ARDS是一種常見的災難性臨床綜合征,自1967年Ashbaugh等[2]報道以來,該病的流行病學、發(fā)病機制及治療策略等方面有重要的進展,但缺乏有效的治療方法,病死率仍居高不下(40% -60%)[3]。目前ALI/ARDS的治療方法主要是支持治療和抗炎治療,療效不明顯,關鍵是其發(fā)生機制尚不很清楚。
本研究采用氣管內滴入LPS復制大鼠ALI模型[4],滴入 LPS后 6 h,LPS 組動物肺組織出現典型的ALI變化:動脈氧分壓顯著下降,肺濕/干重比、BALF中蛋白濃度、中性粒細胞比明顯增加,與正常對照組相比,上述各項指標均有顯著差異,說明本實驗的動物模型是成功的。
ALI的本質是一種炎癥[5],在細胞水平上表現為單核巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞的浸潤;在分子水平則表現為黏附因子的過度表達及多種炎癥介質的產生。
NF-κB是一類能與多種基因啟動子或增強子部位κB位點發(fā)生特異性結合并促進其轉錄的蛋白質,是ALI炎癥反應的主要炎癥介質和轉錄因子[6],在細胞因子瀑布效應中發(fā)揮著開關作用。NF-κB的持續(xù)活化與肺損傷的嚴重程度有關,在ALI的炎癥介質網絡調控中起中心環(huán)節(jié)作用[7],阻斷NF-κB途徑對即使已發(fā)生的肺部炎癥是有利的[8]。
MAPK是信號由細胞表面轉導到細胞內部的重要傳遞者,在控制炎癥反應中具有重要作用[9],它的持續(xù)激活引起炎癥細胞因子的不斷產生,導致級聯“瀑布”效應。
目前認為,MAPK信號通路中與激活NF-κB關系最為密切的是p38MAPK,它是激活NF-κB的主角。用?;悄懰徕c誘導急性胰腺炎模型鼠發(fā)現,巨噬細胞p38MAPK活性增強,同時伴有NF-κB的激活[10],因此抑制p38MAPK的表達可以抑制NF-κB活性。p38MAPK信號通路在介導細胞對LPS的激活反應中發(fā)揮著重要作用,它的磷酸化導致一系列的PMN 的前炎癥效應[11],活化的 p38MAPK、NF-κB能以極快的速率磷酸化,引起呼吸爆發(fā),釋放大量氧自由基,導致細胞損傷[12],同時在轉錄水平誘導iNOS和COX2等細胞因子的基因表達[13],導致失控性炎癥反應。p38MAPK抑制劑能降低肺毛細血管通透性,改善肺病理學損害,完全預防急性胰腺炎相關的肺損傷[14]。近年來,通過抑制p38MAPK減輕ALI提示p38MAPK抑制劑具有一定的應用前景[15,16]。
血紅素氧合酶(heme oxygenase,HO)是血紅素分解的關鍵酶和限速酶,現已證明HO有3種異構體,其中HO-1是一種應急反應性蛋白,作用廣泛,具有抑制細胞凋亡和抗炎作用;其降解產物膽紅素、膽綠素及一氧化碳(CO)可能在這方面起著重要作用。膽紅素、膽綠素能減輕白細胞與血管內皮細胞的黏附,抑制NADPH氧化酶的激活[17]、抑制單核細胞的趨化;膽紅素還有抗補體特性,保護細胞免遭補體活化介導的炎癥損傷。
本研究發(fā)現,在使用HO-1誘導劑Hemin和p38MAPK抑制劑SB203580后HO-1顯著升高,p38MAPK、NF-κB蛋白表達明顯下降;而在使用HO-1抑制ZnPPIX后HO-1顯著下降,比LPS組更低,p38MAPK、NF-κB明顯升高,較LPS組更高,說明HO-1活性增高抑制了p38MAPK、NF-κB的表達,反之亦然,HO-1與p38MAPK、NF-κB是相互抑制的。這與姚 琳等[13]、Ryter等[18]提到的 p38MAPK 和NF-κB處于iNOS和HO-1的上游相反。
總之,在ALI中HO-1與p38MAPK/NF-κB是兩條獨立的信號轉導途徑,從而為臨床治療ALI提供新的思路。
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