詹麗英， 李文瀾△， 柯 偉， 夏中元

(1武漢大學人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430060;2湖北省中山醫(yī)院神經內科，湖北 武漢 430033)

內毒素存在于革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜中，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)為其主要成份。內毒素所致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是臨床上常見的急危重綜合征，很多疾病可并發(fā)內毒素性ALI。ALI作為全身炎癥反應病理進程中的早期階段，常發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiartory distress syndrome，ARDS)，是創(chuàng)傷、休克、外科感染等疾病致死的主要原因之一［1］。本研究將選用氣管內滴注內毒素急性肺損傷模型，探討在 ALI中p38MAPK、NF－κB與HO－1的相互關系，為臨床治療提供理論依據。

材料和方法

1 材料

LPS、4－(4－氟苯基)－2－(4－甲基亞磺?；交?－5－(4－吡啶基)－1H－咪唑(SB203580，p38MAPK抑制劑，Sigma)、鋅原卟啉 IX(ZnPPIX，血紅素氧合酶 －1抑制劑，Sigma)，血晶素(Hemin，血紅素氧合酶 －1誘導劑，Sigma)，BCA檢測試劑盒(Pierce)，兔抗大鼠MAPK(p38)抗體(BD)，兔抗大鼠NF－κB(p65)抗體(NeoMarkers)，anti－β－actin抗體(Santa Cruz)，羊抗兔HRP－IgG(eBioscience)。

健康雄性Wistar大鼠40只，體重200－250 g，由武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

2 方法

2.1 實驗動物模型的制備及分組

實驗前禁食12 h，自由飲水。大鼠用7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定消毒后逐層暴露氣管，動脈穿刺針(24號)經環(huán)甲膜向心端刺入氣管，LPS組用1 mL注射器抽取無菌生理鹽水配制的LPS溶液2.5 mg/kg連接穿刺針，回抽見空氣無阻力后將藥液緩慢滴入氣管中，拔出穿刺針，將大鼠直立旋轉，使藥液在肺內分布均勻，縫合切口后觀察。

動物分組:(1)對照組或生理鹽水組(NS組):氣管內給予等容積生理鹽水;(2)內毒素組(LPS組):氣管內滴注LPS 2.5 mg/kg;(3)血紅素氧合酶－1誘導劑血晶素+內毒素組(Hemin+LPS組):在氣管內滴注LPS前18 h腹腔注射Hemin 75 μmol/kg;(4)血紅素氧合酶－1抑制劑鋅原卟啉IX+內毒素組(Zn-PPIX+LPS組):在氣管內滴注LPS前18 h腹腔內注射ZnPPIX 40μmol/kg;(5)p38MAPK抑制劑SB203580+內毒素組(SB+LPS組):在氣管內滴注LPS前2 h SB203580以5 μmol/kg 2 h持續(xù)股靜脈泵入。

2.2 標本的采集及處理 LPS或NS滴注后6 h，頸動脈抽血2 mL，其中1 mL立即行血氣分析。之后頸動脈放血處死動物，開胸后結扎右側肺門，氣管切開，插入0.2 cm硅膠管，用4℃生理鹽水2 mL反復灌洗右肺2次，記錄灌洗液回收量，每次回收量無明顯差異，離心(3000 r/min)10 min，取上清液－70℃保存;測量右肺上葉濕/干重比;取右肺下葉肺組織行p38MAPK、NF－κB蛋白檢測;取右肺中葉行免疫組化染色和HE染色。

2.3 檢測指標及方法

①支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中性粒細胞(neutrophil)比 取BALF液沉淀，制細胞懸液少量于玻片，瑞氏－姬姆薩染色，油鏡下數200個細胞，得出多形核白細胞、分類計數，計算中性粒細胞百分比。

②BALF中蛋白含量 考馬斯亮藍蛋白測定法測BALF中蛋白含量。

③ 肺濕/干重比(wet/dry weight ratio，W/D) 取右肺上葉，濾紙吸干表面附著水分，用分析天平準確測量肺組織濕重，并記錄，于80℃恒溫箱烤72 h至肺干重恒定，稱其濕、干重，計算肺濕/干重(W/D)比值。

④動脈血氣(arterial blood gas，ABG) 按要求將血液填充到i－STAT手提式血氣分析儀配套的血氣分析測試片(i－STAT EG7+cartridge)加樣池中，避免氣泡產生，將標本插入自動血氣分析儀，讀取動脈氧分壓(arterial oxygen pressure，PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide in artery，PaCO2)和碳酸氫根(bicarbonate radical，HCO－3)值。⑤Western blotting法檢測肺組織p38MAPK、NF－κB蛋白表達 開胸取出右下肺組織，低溫保存，將肺組織標本用PBS洗滌2次后，加入裂解緩沖液，冰浴內勻漿，4℃ 12000 r/min離心30 min以除去組織碎片。取上清，用BCA檢測試劑盒檢測總蛋白濃度。取50 μg蛋白溶于2×SDS上樣緩沖液中，將樣本100℃煮沸5 min后，將上述各樣品經質量濃度10%SDS－PAGE凝膠，轉移至PVDF膜，用質量濃度5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h后，將 PVDF膜與Ⅰ抗(p38MAPK抗體，β－actin抗體)孵育，用TBST洗3次后將膜與HRP標記Ⅱ抗孵育1 h。TBST漂洗后，ECL顯色，X片曝光，照相。使用凝膠成像分析系統(tǒng)對顯色條帶進行吸光度分析。以樣本的平均吸光度除以相應內參照的平均吸光度，即為樣本蛋白的相對含量，然后將各樣本蛋白的相對含量間做統(tǒng)計分析圖。

⑥HO－1蛋白表達 開胸取出右肺中葉組織，體積分數10%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水石蠟包埋，制備3 μm厚的切片。SP法免疫組化染色按操作說明實施。陽性結果判斷:以肺組織切片細胞胞漿中出現棕黃色顆粒狀沉淀物為陽性細胞。將切片置Olympus顯微鏡(400倍)下，對所測視野進行準確定位，由攝像系統(tǒng)提取數值化細胞圖像，輸入HPIAS－2000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(同濟千屏影像公司)進行處理，每標本隨機選取8個不重疊的視野，測定免疫組化陽性顆粒的平均光密度值，并計算8個視野吸光度值的均值，對HO－1蛋白表達做半定量分析。

⑦病理觀察 開胸取出右肺中葉0.5 cm×0.5 cm組織行光鏡觀察。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 肺組織濕/干重比、支氣管肺泡灌洗液中細胞計數比及蛋白含量

與NS組比較，LPS組、Hemin+LPS組、SB+LPS組、ZnPPIX+LPS組肺組織濕/干重明顯增加(P＜0.05)，中性粒細胞比、蛋白含量顯著增加(P＜0.05或P＜0.01);與LPS組比較，Hemin+LPS組、SB+LPS組肺組織濕/干重、中性粒細胞比、蛋白含量明顯減少(P＜0.05)，而ZnPPIX+LPS組顯著增加(P＜0.05);Hemin+LPS組、SB+LPS組之間無顯著差異(P ＞0.05)，見表1。表1 肺組織濕/干重比、支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞比及蛋白含量

Table 1.The ratio of neutrophils protein content of BALF and the ratio of W/D(.n=8)

Table 1.The ratio of neutrophils protein content of BALF and the ratio of W/D(.n=8)

△P＜0.05，△△P ＜0.01 vs NS group;▲P ＜0.05 vs LPS group.

2 動脈血氣

滴注LPS 6 h后，PaO2、PaCO2和HCO－3較NS組顯著下降(P＜0.05)。Hemin+LPS組、SB+LPS組PaO2、PaCO2和HCO－3明顯高于LPS組，而ZnPPIX+LPS組明顯下降(P＜0.05)，Hemin+LPS組、SB+LPS組之間無顯著差異(P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.Results of arterial blood gas analysis..n=8.△P＜0.05 vs NS group;▲P＜0.05 vs LPS group.圖1 動脈血氣結果

3 肺組織p38MAPK、NF－κB蛋白表達

與NS組比較，LPS組、Hemin+LPS組、SB+LPS組、ZnPPIX+LPS組p38MAPK、NF－κB蛋白表達明顯增高(P＜0.05);與LPS組比較，Hemin+LPS組、SB+LPS組的p38MAPK、NF－κB蛋白表達顯著降低(P ＜0.05)，ZnPPIX+LPS組 p38MAPK、NF－κB蛋白表達明顯增高(P＜0.05);Hemin+LPS組、SB+LPS組的p38MAPK、NF－κB蛋白表達無顯著差異(P ＞0.05)，見圖2、3。

4 肺組織HO－1表達

NS組HO－1免疫組化染色，基本未見陽性表達細胞;與NS組比較，LPS組肺組織HO－1強陽性表達(P＜0.01)，HO－1主要表達部位在支氣管、肺泡上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞，見圖4A－E;與LPS組相比，Hemin+LPS組、SB+LPS組HO－1的表達明顯升高(P＜0.05)，ZnPPIX+LPS組HO－1的表達明顯降低(P＜0.05)，Hemin+LPS組、SB+LPS組之間無顯著差異(P＞0.05)，見圖5。

Figure 2.Expression of p38MAPK in lung tissue..n=8.△P＜0.05，△△P＜0.01vs NS group;▲P ＜0.05 vs LPS group.圖2 肺組織中p38MAPK表達

Figure 3.Expression of NF－κB in lung tissue..n=8.△P＜0.05，△△P ＜0.01 vs NS group;▲P ＜0.05 vs LPS group.圖3 肺組織中NF－κB的表達

Figure 4.HO －1 immunohistochemistry staining of lung tissue(×400).A:NS;B:LPS;C:Hemin+LPS;D:ZnPPIX+LPS;E:SB+LPS.圖4 大鼠肺組織HO－1免疫組化

Figure 5.Expression of HO－1 in lung tissue..n=8.△P＜0.05，△△P ＜0.01vs NS group;▲P ＜0.05 vs LPS group.圖5 肺組織HO－1表達

5 肺組織形態(tài)學

(1)NS組:肺組織肺泡結構清晰，肺泡壁薄，未見出血水腫等明顯炎癥病理改變(HE×400)。(2)LPS組:肺泡腔變窄，肺泡壁增厚;肺間質充血、水腫、炎癥細胞浸潤，肺泡腔內可見粒細胞明顯增多，并見局部肺氣腫。(3)Hemin+LPS組:肺間隔炎癥細胞浸潤較LPS組明顯減輕，毛細血管增生不明顯。(4)ZnPPIX+LPS組:肺泡腔明顯變窄，肺間質明顯充血、水腫，大量炎癥細胞浸潤。(5)SB+LPS組:支氣管壁周圍稍有增厚，肺泡大小形態(tài)稍不規(guī)則，損傷程度亦明顯小于LPS組，見圖6A－E。

Figure 6.HE staining of lung tissue.A:NS;B:LPS;C:Hemin+LPS;D:ZnPPIX+LPS;E:SB+LPS.圖6 大鼠肺組織HE染色

討 論

ALI/ARDS是一種常見的災難性臨床綜合征，自1967年Ashbaugh等［2］報道以來，該病的流行病學、發(fā)病機制及治療策略等方面有重要的進展，但缺乏有效的治療方法，病死率仍居高不下(40% －60%)［3］。目前ALI/ARDS的治療方法主要是支持治療和抗炎治療，療效不明顯，關鍵是其發(fā)生機制尚不很清楚。

本研究采用氣管內滴入LPS復制大鼠ALI模型［4］，滴入 LPS后 6 h，LPS 組動物肺組織出現典型的ALI變化:動脈氧分壓顯著下降，肺濕/干重比、BALF中蛋白濃度、中性粒細胞比明顯增加，與正常對照組相比，上述各項指標均有顯著差異，說明本實驗的動物模型是成功的。

ALI的本質是一種炎癥［5］，在細胞水平上表現為單核巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞的浸潤;在分子水平則表現為黏附因子的過度表達及多種炎癥介質的產生。

NF－κB是一類能與多種基因啟動子或增強子部位κB位點發(fā)生特異性結合并促進其轉錄的蛋白質，是ALI炎癥反應的主要炎癥介質和轉錄因子［6］，在細胞因子瀑布效應中發(fā)揮著開關作用。NF－κB的持續(xù)活化與肺損傷的嚴重程度有關，在ALI的炎癥介質網絡調控中起中心環(huán)節(jié)作用［7］，阻斷NF－κB途徑對即使已發(fā)生的肺部炎癥是有利的［8］。

MAPK是信號由細胞表面轉導到細胞內部的重要傳遞者，在控制炎癥反應中具有重要作用［9］，它的持續(xù)激活引起炎癥細胞因子的不斷產生，導致級聯“瀑布”效應。

目前認為，MAPK信號通路中與激活NF－κB關系最為密切的是p38MAPK，它是激活NF－κB的主角。用?；悄懰徕c誘導急性胰腺炎模型鼠發(fā)現，巨噬細胞p38MAPK活性增強，同時伴有NF－κB的激活［10］，因此抑制p38MAPK的表達可以抑制NF－κB活性。p38MAPK信號通路在介導細胞對LPS的激活反應中發(fā)揮著重要作用，它的磷酸化導致一系列的PMN 的前炎癥效應［11］，活化的 p38MAPK、NF－κB能以極快的速率磷酸化，引起呼吸爆發(fā)，釋放大量氧自由基，導致細胞損傷［12］，同時在轉錄水平誘導iNOS和COX2等細胞因子的基因表達［13］，導致失控性炎癥反應。p38MAPK抑制劑能降低肺毛細血管通透性，改善肺病理學損害，完全預防急性胰腺炎相關的肺損傷［14］。近年來，通過抑制p38MAPK減輕ALI提示p38MAPK抑制劑具有一定的應用前景［15，16］。

血紅素氧合酶(heme oxygenase，HO)是血紅素分解的關鍵酶和限速酶，現已證明HO有3種異構體，其中HO－1是一種應急反應性蛋白，作用廣泛，具有抑制細胞凋亡和抗炎作用;其降解產物膽紅素、膽綠素及一氧化碳(CO)可能在這方面起著重要作用。膽紅素、膽綠素能減輕白細胞與血管內皮細胞的黏附，抑制NADPH氧化酶的激活［17］、抑制單核細胞的趨化;膽紅素還有抗補體特性，保護細胞免遭補體活化介導的炎癥損傷。

本研究發(fā)現，在使用HO－1誘導劑Hemin和p38MAPK抑制劑SB203580后HO－1顯著升高，p38MAPK、NF－κB蛋白表達明顯下降;而在使用HO－1抑制ZnPPIX后HO－1顯著下降，比LPS組更低，p38MAPK、NF－κB明顯升高，較LPS組更高，說明HO－1活性增高抑制了p38MAPK、NF－κB的表達，反之亦然，HO－1與p38MAPK、NF－κB是相互抑制的。這與姚 琳等［13］、Ryter等［18］提到的 p38MAPK 和NF－κB處于iNOS和HO－1的上游相反。

總之，在ALI中HO－1與p38MAPK/NF－κB是兩條獨立的信號轉導途徑，從而為臨床治療ALI提供新的思路。

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