褚薇薇， 聶 蕾， 和新盈， 閆愛麗， 周 伊， 吳庚利， 張潤岐

(西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部病理教研室，陜西 西安 710021)

肺是腸缺血－再灌注損傷最常見的受損靶器官之一［1］。常見于腹腔動脈、腸系膜上動脈、門靜脈阻斷后恢復(fù)血流過程引起的急性肺損傷。急性肺損傷是臨床一種常見的危重病，死亡率高。因此，研究腸缺血－再灌注致急性肺損傷的發(fā)生機(jī)制和尋找相應(yīng)的防治措施具有十分重要的臨床意義。

缺血后處理是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的外科機(jī)械性干預(yù)措施，即再灌注前給予反復(fù)短暫的再灌注/停灌注的方法［2］。目前，缺血后處理已經(jīng)成為缺血－再灌注損傷研究領(lǐng)域中的熱點，但大多集中在缺血－再灌注損傷的心肌和肝臟方面，對腸缺血－再灌注致急性肺損傷的作用及其機(jī)制的研究國內(nèi)外少見報道［3］。課題組前期工作已經(jīng)探討了后處理抗大鼠腸缺血－再灌注損傷的作用及其機(jī)制［4］。本研究通過觀測后處理對腸缺血－再灌注大鼠肺組織凋亡相關(guān)基因的影響，進(jìn)一步深入研究其對腸缺血－再灌注致肺損傷的作用及其機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 第1條鏈合成試劑盒購自Fermentas。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。凋亡調(diào)控蛋白 B cell lymphoma/leukemia－2(Bcl－2)、Bcl－2 associated X(Bax)和 caspase－3 mAb由Santa Cruz提供。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗、小鼠抗β－actin mAb由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 動物 健康雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠，24只，體重230－280 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，術(shù)前禁食12 h，不禁水。

2 方法

2.1 動物模型復(fù)制 腹腔注射200 g/L烏拉坦(1.0 g/kg)麻醉后，仰臥固定于操作板上，消毒后取腹正中切口長約3 cm進(jìn)腹，用溫鹽水紗布將腸管推向左側(cè)腹腔，暴露右腎內(nèi)上方的腸系膜根部，找到腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)，在其根部用無創(chuàng)傷血管夾夾閉阻斷SMA血運(yùn)45 min，造成腸缺血模型，然后松夾，再灌注6 h后經(jīng)頸動脈放血處死。

2.2 實驗動物分組及處理 動物隨機(jī)分為3組(n=8):(1)假手術(shù)(sham)組:僅行開腹，分離SMA不夾閉;(2)缺血－再灌注(ischemia－reperfusion，I/R)組:方法見模型復(fù)制;(3)缺血后處理(ischemic postconditioning，IPOST)組:缺血45 min后即刻行3個循環(huán)(灌注30 s后阻斷30 s)，余同I/R組。于再灌注6 h后，各組大鼠處死取材。

2.3 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察 左肺下部用10%中性甲醛固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色后光鏡下觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

2.4 肺組織濕/干比值檢測 各組大鼠處死后，開胸取雙肺，濾紙吸干肺表面水分和血跡后稱重，置85℃ 烘箱內(nèi)，干燥24 h至恒重，再稱重，計算肺組織濕重與干重比值(lung wet/dry weight ratio，W/D)，表示肺水腫形成情況。

2.5 大鼠肺組織 Bcl－2、Bax和 caspase－3 mRNA表達(dá)的檢測 采用RT－PCR方法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，PCR擴(kuò)增 Bcl－2、Bax和 caspase－3。Bcl－2引物上游5'－CTGGTGGACAACATCGCTCTG －3'，下游5'－ GGTCTGCTGACCTCACTTGTG － 3'，產(chǎn)物長度為228 bp。Bax引物上游5'－TCCAGGATCGAGCAGA－3'，下游5'－AAGTAGAAGAGGGCAACC －3'，產(chǎn)物長度為256 bp。Caspase－3引物上游 5'－GGAGCTGGACTGTGGCATTGA －3'，下游 5'－ CAGTTCTTTCGTGAGCATGGA－3'產(chǎn)物長度為232 bp。β－actin引物上游5'－ATTGTAACCAACTGGGACG －3'，下游 5'－TTGCCGATAGTGATGACCT －3'，產(chǎn)物長度為 533 bp。采用終體積為25 μL的反應(yīng)體系，94℃ 1 min，55℃1 min，72 ℃ 1 min，擴(kuò)增 35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。10 μL的PCR產(chǎn)物加入凝膠加樣孔中，80 V電壓行電泳40 min后紫外光下觀察和記錄結(jié)果并照相保存。在Gel Doc(Bio－Rad)凝膠成像分析系統(tǒng)上掃描定量。以β－actin為內(nèi)參照，根據(jù)各條帶的A值分析Bcl－2、Bax mRNA表達(dá)水平。

2.6 大鼠肺組織Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白表達(dá)的檢測 肺組織蛋白提取后，BCA法測定蛋白含量，按每泳道加總蛋白50 μg進(jìn)行SDS－PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入小鼠抗大鼠Bcl－2、Bax和caspase－3(1∶1000)Ⅰ抗，4℃孵育過夜，吐溫20－磷酸鹽緩沖液洗膜4次，每次15 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶6000)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(enhanced chemiluminescene，ECL)顯色20 min，X 光片曝光。β－actin作為內(nèi)參照，對上樣一致性進(jìn)行評估。采用GDS－8000型凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析和檢驗，組間比較采用方差分析，當(dāng)P＜0.05時，進(jìn)一步作均數(shù)的兩兩比較用q檢驗。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

結(jié) 果

1 大鼠肺組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠肺組織未見明顯形態(tài)學(xué)異常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡內(nèi)未見水腫液及血液淤滯;缺血－再灌注組大鼠可見肺泡間隔明顯增寬、毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、大量炎癥細(xì)胞浸潤等;缺血后處理組以上病理改變均較缺血－再灌注組有不同程度緩解，見圖1。

2 肺組織濕/干比值

與假手術(shù)組相比，缺血－再灌注組肺組織W/D明顯增加(P＜0.05)，而缺血后處理組肺組織W/D則顯著低于缺血－再灌注組(P＜0.05)，見圖2。

Figure 1.Histopathological changes of rat lungs 6 h after intestine ischemia/reperfusion(I/R)injury(HE staining，×100).A:sham group;B:I/R group;C:ischemic postconditioning group.圖1 大鼠肺組織病理變化

3 大鼠肺組織Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA表達(dá)的變化

假手術(shù)組大鼠肺組織Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA的表達(dá)相對較低或不表達(dá);缺血－再灌注組大鼠肺組織Bcl－2 mRNA表達(dá)下調(diào)，Bax和caspase－3 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05);而缺血后處理組Bcl－2 mRNA表達(dá)水平明顯高于缺血－再灌注組(P＜0.05);Bax和caspase－3 mRNA表達(dá)量則明顯低于缺血－再灌注組(P＜0.05)，見圖3、4。

Figure 2.Lung W/D ratio of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion..n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs I/R group.I/R:intestine ischemia/reperfusion.IPOST:ischemic postconditioning.圖2 各組大鼠肺組織W/D變化

Figure 3.The mRNA expression of Bcl－2，Bax and caspase－3 in lungs of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion.Lane 1:sham group;Lane 2:intestine I/R group;Lane 3:IPOST group;M:DNA marker(100 bp).圖3 大鼠肺組織中Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA的表達(dá)

Figure 4.The mRNA expression of Bcl－2，Bax and caspase－3 in lungs of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion..n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs I/R group.圖4 大鼠肺組織中Bcl－2、Bax和caspase－3 mRNA的表達(dá)

4 大鼠肺組織Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白表達(dá)的變化

假手術(shù)組大鼠肺組織Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達(dá)相對較低或不表達(dá);缺血－再灌注組大鼠肺組織Bcl－2蛋白表達(dá)水平下降，Bax和caspase－3蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05);而缺血后處理組Bcl－2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05);Bax和caspase－3蛋白表達(dá)量則明顯降低(P＜0.05)，見圖5、6。

Figure 6.Comparison of the protein expression of Bcl－2，Bax and caspase－3 in lungs of rats 6 h after intestine ischemia/reperfusion..n=8.*P＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs I/R group.圖6 大鼠肺組織中Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達(dá)

討 論

缺血－再灌注損傷能造成遠(yuǎn)隔器官受損，即非缺血區(qū)域組織器官功能的損傷。腸缺血－再灌注損傷不僅可以引起腸道局部的組織損害和腸道機(jī)械屏障功能受損，而且可以導(dǎo)致腸源性細(xì)菌和內(nèi)毒素移位進(jìn)入體循環(huán)造成全身擴(kuò)散。肺是腸缺血－再灌注損傷最常見的受損靶器官之一［1］。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血－再灌注組大鼠出現(xiàn)肺泡壁增寬、大量炎癥細(xì)胞浸潤、毛細(xì)血管擴(kuò)張、血液淤滯等病理變化。

腸缺血－再灌注損傷誘發(fā)體內(nèi)細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的激活，進(jìn)而啟動嗜中性白細(xì)胞在肺內(nèi)聚集并釋放氧自由基引起細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致急性肺損傷的中心環(huán)節(jié)。細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的主動性細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為凋亡信號通路的啟動及相關(guān)基因的表達(dá)。其中Bcl－2家族成員是細(xì)胞凋亡過程中的一類重要抑凋亡基因;另一類是促凋亡基因如Bax等。細(xì)胞凋亡的發(fā)生很大程度上取決于促凋亡成員和抑凋亡成員的相對濃度［5－7］。Bcl－2 和 Bax分別是典型的抑凋亡和促凋亡蛋白。Bcl－2蛋白主要分布于核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體膜上。Bax正常情況主要位于細(xì)胞質(zhì)中，在凋亡信號誘導(dǎo)后很快遷移到線粒體，2個Bax蛋白相互聚合形成同二聚體，作為細(xì)胞色素C通過線粒體膜進(jìn)入胞質(zhì)的通道，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由此看出，Bcl－2/Bax兩蛋白之間比例是決定對細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腸缺血－再灌注組大鼠肺組織Bcl－2 mRNA和蛋白表達(dá)水平下降，而Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平則明顯升高，提示大鼠腸缺血－再灌注損傷致肺組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生與凋亡調(diào)控基因Bcl－2和Bax的表達(dá)異常有關(guān)。

Vinten－Johansen等［8］發(fā)現(xiàn)，缺血后處理可減少再灌注損傷特別是心肌梗死、細(xì)胞凋亡。Dosenko等［9］證明缺氧后處理不僅能減少心肌再灌注時細(xì)胞的壞死也能減少細(xì)胞凋亡。本研究采用3個循環(huán)的30s灌注后30s阻斷的缺血后處理，大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化緩解，水腫程度減輕，提示后處理具有抗腸缺血－再灌注致肺損傷的作用。本實驗結(jié)果還顯示，缺血后處理可使Bcl－2 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平升高，Bax mRNA和蛋白表達(dá)降低。提示后處理可通過上調(diào)Bcl－2 mRNA和蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax mRNA和蛋白表達(dá)，從而減輕腸缺血－再灌注致肺損傷的作用。為了進(jìn)一步證明缺血后處理的這種保護(hù)作用，本研究還檢測了caspase－3的表達(dá)，結(jié)果顯示，缺血后處理組大鼠肺組織中caspase－3 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯低于缺血－再灌注組，表明后處理可通過抑制caspase－3的活化減少肺組織細(xì)胞凋亡。

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