伍 蕊， 陳亞紅△， 姚婉貞， 王配配， 耿 彬， 唐朝樞

(北京大學(xué)1第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，2醫(yī)學(xué)部生理及病理生理系，北京 100191)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)參與的慢性氣道炎癥性疾病，具有反復(fù)發(fā)作性氣道阻塞和氣道反應(yīng)性增高的特點(diǎn)。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)在卵白蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)的大鼠急性支氣管哮喘模型中，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)/胱硫醚 － γ－裂解酶(cystathionine－lyase，CSE)體系下調(diào)，外源性給予硫氫化鈉(NaHS，H2S供體)后，可明顯緩解哮喘大鼠的氣道炎癥，提示H2S/CSE體系參與了哮喘的發(fā)病過程［1，2］。支氣管平滑肌增殖、肥厚是哮喘的主要病理表現(xiàn)。已有研究表明尾加壓素Ⅱ(urotensin II，U－Ⅱ)作為平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞增殖的相關(guān)指標(biāo)參與了干預(yù)的發(fā)?。?，4］。那么，H2S 是否通過對 U － Ⅱ的調(diào)節(jié)而在哮喘發(fā)病中發(fā)揮作用呢，尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)擬以O(shè)VA誘導(dǎo)大鼠急性哮喘模型，探討應(yīng)用外源性NaHS處理對哮喘大鼠U－Ⅱ表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物分組及處理

健康SD雄性大鼠(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心)24只，鼠齡5－6周，平均體重(180±10)g，SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、哮喘組和NaHS干預(yù)組，每組8只。

1.1 哮喘組 第1 d和第8 d大鼠各腹腔內(nèi)注射10%OVA抗原混懸液(OVA 100 mg+氫氧化鋁干粉100 mg+滅活百日咳菌苗(5×109個(gè))1 mL，第15 d開始激發(fā)，霧化吸入1%OVA液每天霧化1次，每次約30 min。連續(xù)14 d，處理大鼠前1 h再霧化吸入1次［5］。

1.2 NaHS干預(yù)組 第15 d開始于每次激發(fā)前30 min給予 NaHS(每天 14 μmol/kg)腹腔注射，溶于0.5 mL生理鹽水中，其余致敏及激發(fā)同哮喘組［6］。1.3 正常對照組 第1 d和第8 d用生理鹽水1 mL代替抗原進(jìn)行腹腔注射致敏，第15 d開始用生理鹽水30 mL霧化激發(fā)，每天1次，每次30 min，連續(xù)14 d。

2 肺功能測定

按文獻(xiàn)［7］方法測定氣道阻力，腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠，氣管插管后與Powerlab多導(dǎo)生理測試儀相連，設(shè)置呼吸機(jī)潮氣量為10 mL/kg，呼吸頻率為60次/min。經(jīng)Chart 4.1軟件分析測定每只大鼠的最大吸氣峰流速(peak inpiratory flow，PIF)、最大呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)、吸氣內(nèi)壓(inpiratory pressure，IP)及氣道內(nèi)壓上升斜率(inpiratory pressure slope，IPSlope)。

3 支氣管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)

結(jié)扎大鼠左主支氣管后經(jīng)氣管插管行BAL(分2次進(jìn)行)，每次注入4℃生理鹽水2 mL，反復(fù)抽吸3次，回收支氣管肺泡灌洗液(BALF)，回收率為70.0% －87.5%。取 50 μL計(jì)細(xì)胞總數(shù)，其余以3000 r/min離心10 min后收集上清液，分裝于－80℃保存待測。采用離心沉渣涂片，瑞氏－姬姆薩染色作細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

4 病理學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)大鼠放血并處死后取整個(gè)左肺于4%多聚甲醛固定，在左肺矢狀面距肺外緣約2 mm及4 mm處縱切面取材并蘇木精－伊紅(HE)染色。按文獻(xiàn)［8，9］的方法對各組大鼠氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤評分。(1)無炎癥細(xì)胞為0分;(2)少許炎癥細(xì)胞為1分;(3)較多分布不均的炎癥細(xì)胞為2分;(4)大量炎癥細(xì)胞，分布較均勻，少見聚集成團(tuán)為3分;(5)大量炎癥細(xì)胞聚集成團(tuán)為4分。

5 血漿、肺組織及肺泡灌洗液U－Ⅱ含量測定

采用放射免疫測定法，U－Ⅱ放射免疫試劑盒由Phoenix提供，測定方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

病理評分為非正態(tài)分布時(shí)以中位數(shù)(四分位數(shù))表示，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman直線相關(guān)分析，組間差異比較采用秩和檢驗(yàn)。其余數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多樣本間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson直線相關(guān)分析。統(tǒng)計(jì)計(jì)算均由SPSS 10.0軟件完成。

結(jié) 果

1 一般情況

哮喘組大鼠于OVA液霧化時(shí)均出現(xiàn)喘息、呼吸困難及煩躁癥狀，霧化吸入后大鼠倦怠，意識差;NaHS干預(yù)組大鼠于OVA液霧化吸入時(shí)偶見煩躁、霧化吸入后大鼠基本無倦怠表現(xiàn)，意識尚好;對照組大鼠意識好，體重增長相對較快，毛白，有光澤。

2 肺功能

對照組大鼠PEF、IPSlope分別為(6.5±0.1)L/s、(1.4±0.1)L/s，哮喘組分別為(2.9 ±0.7)L/s)、(1.9±0.1)L/s，NaHS干預(yù)組分別為(5.7±0.5)L/s、(2.1 ±0.1)L/s，3 組間差異顯著(F 值分別為112.129、45.371，均 P ＜0.01)。

3 組織病理學(xué)改變

對照組大鼠支氣管纖毛柱狀上皮完整，纖毛排列整齊，各級支氣管黏膜上皮僅見散在杯狀細(xì)胞，未見明顯平滑肌增生，管腔內(nèi)無黏液和炎性滲出物，管腔通暢。哮喘組杯狀細(xì)胞明顯增多，黏膜的基底膜增厚伴玻璃樣變，管壁平滑肌肥大，黏膜下及肥厚的肌層內(nèi)可見大量混合性細(xì)胞浸潤，以漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞為主。NaHS干預(yù)組大鼠支氣管黏膜上皮中杯狀細(xì)胞不明顯，黏膜的基底輕度增厚，黏膜下及肌層內(nèi)可見灶狀散在的炎癥細(xì)胞浸潤，以漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞為主，極少見到嗜酸粒細(xì)胞。

3組大鼠光鏡下支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度評分［中位數(shù)(四分位數(shù))］依次為對照組1(0－1)分、哮喘組3(2－4)分，NaHS干預(yù)組1(1－2)分，3組間差異顯著(H=16.925，P＜0.01)。

4 肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及分類比較

3組大鼠肺泡灌洗液回收率及巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)比較無顯著差異(F值分別為0.987、1.532，均 P＞0.05);3組大鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)差異顯著(F值分別為 3.961、9.437、11.865、20.792，均 P ＜ 0.05)，見表1。

表1 3組大鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及分類結(jié)果Table 1.Effect of NaHS on cell differential counts in BALF(.n=8)

表1 3組大鼠支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及分類結(jié)果Table 1.Effect of NaHS on cell differential counts in BALF(.n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs OVA －treated group.

Group Retrieving rate(%)Total cell counts(107cells/L)Cell counts of macrophages(107cells/L)Cell counts of neutrophils(107cells/L)Cell counts of lymphocytes(107cells/L)Cell counts of eosinophils(107cells/L)0 ±0.0 Asthma 80 ±6 72 ±49＊＊ 42 ±30 13.40 ±9.00* 12.40 ±8.50* 4.3 ±2.3*NaHS 83±4 40±20△ 26±12 5.20 ±3.20* 7.90 ±4.60＊＊ 1.0±0.6 Control 80 ±6 31 ±8 30 ±8 0.10 ±0.10 0.40 ±0.10 0.＊△

5 大鼠血漿、肺組織及肺泡灌洗液U－Ⅱ含量

3組大鼠血漿U－Ⅱ含量比較無顯著差異(F=1.546，P＞0.05)。與對照組相比，哮喘組肺組織及肺泡灌洗液U－Ⅱ含量明顯升高，分別為對照組的2.6倍和2.2倍;而NaHS干預(yù)組肺組織及肺泡灌洗液U－Ⅱ含量無顯著差異(t值分別為 －1.866、－1.656，均 P ＞0.05)。與哮喘組比較，NaHS干預(yù)組肺組織及肺泡灌洗液U－Ⅱ含量均降低，分別是哮喘組的32.0%和34.8%，見表2。

表2 3組大鼠血漿、肺組織及肺泡灌洗液UⅡ含量比較Table 2.Serum and lung tissue and BALF UⅡlevels in an OVA－induced asthma model(.n=8)

表2 3組大鼠血漿、肺組織及肺泡灌洗液UⅡ含量比較Table 2.Serum and lung tissue and BALF UⅡlevels in an OVA－induced asthma model(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control;△△P ＜0.01 vs OVA －treated group.

Control 45.3 ±18.1 16.6 ±3.4 26.3 ±7.8 Asthma 61.5 ±27.2 43.8 ±2.0＊＊ 58.0 ±12.3＊＊NaHS 47.3 ±11.8 14.0 ±1.9△△ 20.2 ±6.7△△

6 相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman相關(guān)分析表明，大鼠肺組織及肺泡灌洗液U－Ⅱ含量與光鏡下支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度評分呈顯著正相關(guān)(r值分別為0.746、0.714，P＜0.01)。經(jīng)Pearson直線相關(guān)分析表明，大鼠肺組織及肺泡灌洗液U－Ⅱ含量與PEF呈顯著負(fù)相關(guān)(r值分別為 －0.911、－0.767，均 P ＜0.01)。

討 論

哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，主要包括氣道炎癥、免疫與變態(tài)反應(yīng)、氣道神經(jīng)調(diào)節(jié)以及遺傳機(jī)制等，至今尚未完全闡明。

H2S一直被認(rèn)為是毒性氣體。最近研究發(fā)現(xiàn)其具有重要的生理功能，是繼NO、CO之后第3個(gè)內(nèi)源性氣體信號分子。內(nèi)源性H2S是半胱氨酸在5'－磷酸吡哆醛依賴的酶催化作用下生成的［10］。肺組織和肺血管具有胱硫醚－γ－裂解酶(CSE)的高表達(dá)，是體內(nèi)H2S生成的重要來源之一。H2S同NO、CO一樣具有擴(kuò)張血管和消化道平滑肌、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用［11－13］;另外還具有直接清除氧自由基和硝基自由基等多種生物學(xué)效應(yīng)［14］。Marcello等［15］研究發(fā)現(xiàn)于豚鼠氣道內(nèi)滴入NaHS可以增加胞漿蛋白外滲，且增加氣道阻力，此反應(yīng)可被氣道感覺神經(jīng)末梢辣椒素受體(TRPV1)拮抗劑所減弱，提示內(nèi)源性H2S在呼吸系統(tǒng)方面可能具有一定病理生理意義。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)在OVA誘導(dǎo)的大鼠急性支氣管哮喘模型中，血漿H2S的含量明顯下降，肺組織中H2S的生成量也明顯降低，肺組織中CSE蛋白也明顯下調(diào)，同時(shí)肺組織中CSE活性也明顯下降，提示哮喘急性發(fā)作時(shí)H2S/CSE體系下調(diào)。而外源性給予NaHS后，可明顯改善哮喘大鼠的氣道炎癥，結(jié)果提示H2S/CSE體系參與哮喘的發(fā)病過程，內(nèi)源性H2S/CSE體系的下調(diào)是哮喘發(fā)生的重要機(jī)制之一［2］。

最近證實(shí)，最早從魚的脊髓尾部下垂體中分離出的生長抑素樣環(huán)肽尾加壓素Ⅱ(U－Ⅱ)與其受體GPR14結(jié)合使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，血管收縮。U－Ⅱ作為促分裂的強(qiáng)絲裂原，具有促肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，參與了哮喘的發(fā)?。?，4］。研究還發(fā)現(xiàn)U－Ⅱ在血漿含量并不高，而其在組織中廣泛分布和表達(dá)，提示U－Ⅱ可能類似于內(nèi)皮素，不是一種循環(huán)激素，而可能作為旁/自分泌因子而發(fā)揮效應(yīng)［16］，這一點(diǎn)也已在我們對哮喘患者臨床研究中得以應(yīng)證［3］。支氣管平滑肌增殖、肥厚是哮喘的主要病理表現(xiàn)，H2S是否通過對U－Ⅱ的調(diào)節(jié)而參與了哮喘的病理生理過程呢，尚不清楚。

本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組、哮喘組和NaHS干預(yù)組血漿U－Ⅱ含量無顯著差異。而哮喘組與對照組比較，大鼠PEF降低，光鏡下支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度評分升高，血漿、肺組織及肺泡灌洗液U－Ⅱ含量明顯升高;大鼠肺組織及肺泡灌洗液U－Ⅱ含量與光鏡下支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度評分呈正相關(guān)，與PEF呈負(fù)相關(guān)，這與我們以往的哮喘臨床研究結(jié)果一致［3］，提示U－Ⅱ可能以旁/自分泌的方式加重了哮喘氣道炎癥，從而參與了哮喘的發(fā)病。

另外，研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)與哮喘組比較，NaHS干預(yù)組大鼠PEF明顯升高;支氣管肺泡灌洗液中嗜酸粒細(xì)胞減少;光鏡下支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度評分明顯降低，支氣管黏膜中杯狀細(xì)胞明顯減少，黏膜的基底膜厚度變薄，管壁平滑肌無明顯肥大;血漿、肺組織和肺泡灌洗液U－Ⅱ含量明顯降低，均提示外源性H2S供給可通過抑制U－Ⅱ促分裂作用，而減輕哮喘急性發(fā)作期氣道炎癥，對哮喘急性發(fā)病起到保護(hù)作用。以往的研究也證實(shí)外源性H2S供給可以顯著抑制低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈U－II的表達(dá)，該效應(yīng)可能參與H2S對低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建的調(diào)節(jié)作用。H2S對U－Ⅱ促分裂抑制作用的產(chǎn)生機(jī)制又是什么，還不十分清楚，我們推測可能與H2S抑制蛋白激酶C、抑制絲裂素活化蛋白激酶等信號途徑有關(guān)，這還有待進(jìn)一步研究。

總而言之，本文就硫化氫供體對急性支氣管哮喘大鼠尾加壓素Ⅱ表達(dá)影響的研究顯示哮喘急性發(fā)作時(shí)氣道U－Ⅱ分泌增加，U－Ⅱ可能以旁/自分泌方式參與哮喘的發(fā)病;而H2S外源性供給可通過抑制U－Ⅱ合成/分泌，減輕哮喘急性發(fā)作時(shí)的氣道炎癥，對哮喘急性發(fā)病起到保護(hù)作用。這一發(fā)現(xiàn)對我們進(jìn)一步認(rèn)識氣道信號分子參與哮喘氣道炎癥的發(fā)生機(jī)制有很大幫助，進(jìn)而為研發(fā)哮喘新的治療用藥提供了理論依據(jù)。

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