成蘭云， 門(mén)秀麗， 張連元， 李宏杰， 孔小燕， 趙利軍

(華北煤炭醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 唐山 063000)

近年來(lái)，有越來(lái)越多的證據(jù)表明:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞功能障礙中起重要的作用［1］。但多數(shù)研究集中在對(duì)腦缺血的研究［2－4］。目前關(guān)于ERS在肢體缺血再灌注(limbs ischemia reperfusion，LIR)后肺損傷中作用的研究很少。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)對(duì)氧化應(yīng)激非常敏感，并能觸發(fā)細(xì)胞凋亡通路［5，6］。在 ERS反應(yīng)中，ERS相關(guān)蛋白雙鏈 RNA依賴性蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PRK－like ER associated kinase，PERK)、肌醇需要酶1α (inositol requiring protein 1 －alpha，IRE1α)、活化的轉(zhuǎn)錄因子 4(ATF4 activating transcription factor 4，ATF4)、X－盒結(jié)合蛋白－1(X－box binding protein 1，XBP1)和活化的轉(zhuǎn)錄因子 6(activating transcription factor 6，ATF6)表達(dá)上調(diào)，其中ATF4和XBP1具有細(xì)胞保護(hù)作用。但當(dāng)ERS持續(xù)存在或過(guò)強(qiáng)時(shí)，ATF4和XBP1則誘導(dǎo)CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBP)同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

CHOP又稱生長(zhǎng)停滯及DNA損傷基因(growth arrest and DNA damage inducible gene 153，GADD153)，屬于轉(zhuǎn)錄因子 C/EBP家族，它與其它C/EBPs形成異二聚體［7］。CHOP能誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)，特別是ERS反應(yīng)，并參與ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑［8］。牛磺酸是一種內(nèi)源性氨基酸，它可以在一定程度上調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)，還有抗炎、抗氧化作用，它是一個(gè)很好的細(xì)胞保護(hù)劑［9，10］。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸可以保護(hù)LIR后的肺損傷，但具體機(jī)制尚還不清楚［11］。本研究旨在探討ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在大鼠LIR后肺損傷中的作用及?；撬岬挠绊憽?/p>

材料和方法

1 LIR誘導(dǎo)肺損傷模型的建立

采用我們已成功建立的模型復(fù)制大鼠LIR損傷模型［11］，乙醚淺麻醉下以橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢根部，阻斷血流4 h后松開(kāi)，恢復(fù)血流灌注4 h后分別自頸總動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，按常規(guī)方法采集標(biāo)本。

2 動(dòng)物分組

將大鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。(1)對(duì)照組(control):常規(guī)飼養(yǎng)，雙后肢松弛環(huán)繞橡皮帶，不阻斷血流，其余操作同LIR組，這些大鼠未接受預(yù)處理，也未受到損傷;(2)LIR組:大鼠經(jīng)過(guò)4 h缺血后，回復(fù)血流灌注4 h，未給予預(yù)處理;(3)?；撬犷A(yù)處理組(LIR+taurine):大鼠在再灌注前30 min時(shí)，尾靜脈注入?；撬?00 mg/kg(4%的?；撬崛芙庥?.9%生理鹽水中)，其余操作同LIR組;(4)LIR+生理鹽水(LIR+saline):大鼠在再灌注前30 min由尾靜脈給予相應(yīng)劑量的無(wú)?；撬崴幬锶軇?0.9%生理鹽水)處理，其余操作同LIR組。

3 生化指標(biāo)的測(cè)定

將聚乙烯導(dǎo)管(外徑0.8 mm)插入頸總動(dòng)脈，并用無(wú)菌塑料注射器收集血樣。收集完成后立即封閉注射器，避免與外界空氣交換。用血液氣體分析儀測(cè)動(dòng)脈血CO2分壓(partial pressure of carbon dioxide in artery，PaCO2)和動(dòng)脈血O2分壓(partial pressure of oxygen in artery，PaO2)。

取右肺組織400 mg制備組織勻漿，采用試劑盒(南京建成生物制品公司)測(cè)其超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。Lowry法測(cè)定蛋白含量［13］。

4 Western blotting方法檢測(cè)各組肺組織CHOP蛋白的表達(dá)

取液氮凍存的各組大鼠肺組織各200 mg，加入0.5 mL的組織蛋白裂解液，其主要成分為(mmol/L):β－磷酸甘油20，苯甲酰胺10，焦磷酸鈉50，NaF 50，NaC 150，EDTA 5，EGTA 5，Na3VO40.2，Hepes(pH 7.4)，0.1%Triton X －100，PMSF 0.5，aprotinin 0.1，leupeptin 0.02，0.03% β－巰基乙醇。勻漿器將組織研碎，取出勻漿液4℃ 15000 r/min離心20 min。取上清液，按Bradford法測(cè)量蛋白濃度。取100 μg樣本，于100℃水浴3 min后上樣進(jìn)行SDSPAGE電泳。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(Millipore)，50 g/L脫脂奶粉封閉后，分別加入CHOPⅠ抗(Santa Cruz)(1∶500)和β－actinⅠ抗(Santa Cruz)(1∶500)置4℃冰箱振蕩孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶20000)室溫反應(yīng)1 h。TBST洗滌后，ECL化學(xué)發(fā)光試劑于暗室中顯影，X光膠片曝光，拍照。

5 TUNEL法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡

采用羅氏公司的TUNEL法凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)原位細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

6 實(shí)時(shí)定量PCR(real－time PCR)方法分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)

依RNA提取試劑盒(RNeasyMini Kit，Qiagen)說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行RNA提取。取RNA樣品2 μg，按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Omniscript Reverse Transcriptase，Qiagen)說(shuō)明書(shū)，配制反應(yīng)混合液，PCR儀上37℃反應(yīng)60 min，反應(yīng)產(chǎn)物－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)時(shí)定量PCR，取0.5 μL cDNA作為模板，基因引物序列、退火溫度和產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)定量的引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1.Primer sequences，annealing temperatures and product length of real－time PCR

按實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒 (real－time PCR MasterMix，Toyobo)說(shuō)明書(shū)在冰上準(zhǔn)備 50 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:SYBR green I 25 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 0.5 μL，雙蒸水 23.5 μL。在 ABI 7300 PCR儀上反應(yīng)，條件:95℃預(yù)變性 1 min，95℃ 15 s，60℃(或55℃ )30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)real－time PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，得到每個(gè)樣本的Ct值。β－actin作為內(nèi)參照，利用 2－ΔΔCt公式計(jì)算 XBP －1、ATF4 和 CHOP mRNA 的表達(dá)情況。

7 組織形態(tài)學(xué)觀察

每組動(dòng)物任取2只，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取左上肺迅速浸入10%甲醛溶液中固定，經(jīng)二甲苯處理、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后，光鏡觀察并攝片。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 ?；撬釋?duì)PaO2和PaCO2的影響

各組間動(dòng)物血PaO2和PaCO2差異顯著。與對(duì)照組相比，LIR組的PaO2和PaCO2明顯下降(P＜0.05)，?；撬崽幚斫M PaO2明顯高于LIR組(P＜0.05)，PaCO2也略有升高但無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The changes of PaO2and PaCO2in different groups..n=10.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs LIR group.圖1 各組動(dòng)物PaO2和PaCO2的變化

2 ?；撬釋?duì)肺組織中SOD、CAT和MDA的影響

大鼠肢體缺血再灌注4 h后，肺組織中MDA水平明顯升高(P＜0.01)，?；撬犷A(yù)處理后降低了MDA水平;LIR組與對(duì)照組相比，SOD和CAT活性明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)，而?；撬犷A(yù)處理可明顯提高肺組織SOD和CAT活性，見(jiàn)表2。

表2 各組動(dòng)物肺組織SOD、CAT和MDA含量Table 2.The contents of SOD，CAT and MDA of lung tissues in different groups(.n=10)

表2 各組動(dòng)物肺組織SOD、CAT和MDA含量Table 2.The contents of SOD，CAT and MDA of lung tissues in different groups(.n=10)

#P ＜0.05 vs control group;*P ＜0.05 vs LIR group.

Group SOD(103U/g protein)CAT(103U/g protein)MDA(μmol/g protein)Control 1.85 ±0.25 1.92 ±0.41 101.0 ±17.3 LIR 0.69 ±0.17# 1.13 ±0.35# 151.0 ±19.4#LIR+saline 0.73 ±0.19# 1.21 ±0.28# 143.0 ±11.2#LIR+taurine1.87 ±0.49* 2.05 ±0.46* 122.0 ±12.8*

3 各組肺組織CHOP蛋白的表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，LIR組與生理鹽水預(yù)處理組肺組織CHOP蛋白表達(dá)上調(diào)，而牛磺酸預(yù)處理可降低肺組織中CHOP蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The expression of CHOP protein in ling tissues of rats in various groups detected by Western blotting..n=3.#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs LIR group.圖2 Western blotting方法檢測(cè)各組動(dòng)物肺組織中CHOP蛋白的表達(dá)

4 各組肺組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，LIR組肺組織中的XBP－1、ATF4和CHOP mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(P＜0.05)，與LIR組和LIR+saline組相比，?；撬犷A(yù)處理能明顯抑制缺血再灌注后肺組織中XBP－1、ATF4和CHOP mRNA的表達(dá)(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Real－time PCR was conducted to detect the expression of ATF4，XBP1 and CHOP mRNA of lung tissues in different groups..n=3.#P＜0.05 vs control group;*P ＜0.05 vs LIR group.圖3 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)各組動(dòng)物肺組織ATF4、XBP1和CHOP mRNA的表達(dá)

5 各組大鼠肺組織中的細(xì)胞凋亡情況

TUNEL染色結(jié)果顯示:LIR組和LIR+saline組肺組織陽(yáng)性細(xì)胞增多，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，而對(duì)照組肺組織未見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，?；撬崽幚斫M肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少。?；撬徇@種保護(hù)作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因CHOP及ATF4和XBP－1的表達(dá)下調(diào)一致，見(jiàn)圖4。

6 肺組織形態(tài)學(xué)變化

與對(duì)照組比較，LIR組動(dòng)物肺組織水腫，肺泡隔增寬，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，血管床中有大量炎癥細(xì)胞聚集、附壁，部分動(dòng)物肺泡腔中可見(jiàn)到出血和蛋白滲出物;而?；撬崽幚斫M，肺泡隔輕度增寬，肺泡腔中蛋白滲出物明顯減少，見(jiàn)圖5。

Figure 4.Effect of taurine on apoptosis in lung tissues of rats in various groups(TUNEL，×200).A:control group;B:LIR group;C:LIR+saline group;D:LIR+taurine group.圖4 TUNEL法檢測(cè)各組肺組織中細(xì)胞凋亡情況

Figure 5.Histological changes in lung tissues from different groups(HE，×100).A:control group;B:LIR group;C:LIR+taurine group.圖5 各組動(dòng)物肺組織光鏡下改變

討 論

越來(lái)越多的證據(jù)表明缺血再灌注可引起ERS反應(yīng)，而且ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與了很多疾病的發(fā)生，如糖尿病和缺血再灌注損傷等［12－14］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯合成和細(xì)胞鈣離子儲(chǔ)存的場(chǎng)所，對(duì)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用。ERS可由多種原因引起，如缺氧、鈣離子平衡失調(diào)及自由基侵襲等。我們以前的研究表明LIR后的急性肺損傷與氧化應(yīng)激有密切關(guān)系［11］。而肺組織細(xì)胞可分泌大量蛋白質(zhì)，具有較豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，因此我們推測(cè)，這些細(xì)胞的損傷可能與強(qiáng)烈的ERS反應(yīng)有關(guān)，但有關(guān)LIR后肺損傷與ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

CHOP是一個(gè)b－Zip轉(zhuǎn)錄因子，屬于CCAAT增強(qiáng)子連接蛋白的轉(zhuǎn)錄因子C/EBP家族。正常情況下，CHOP表達(dá)非常低;在ERS時(shí)，通過(guò)以下機(jī)制上調(diào)CHOP表達(dá):(l)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE和ATF6活化［13］，其胞漿活性部分(XBP1和ATF6)進(jìn)入核內(nèi)，與ERS反應(yīng)元件序列中的CCAAT－N9－CCACG相連，然后啟動(dòng)CHOP轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［14］;(2)通過(guò)PERK－eIF2a途徑活化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄子ATF4和ATF3表達(dá)，ATF4結(jié)合氨基酸調(diào)控元件，再誘導(dǎo) CHOP表達(dá)。CHOP可能通過(guò)下調(diào)Bcl－2表達(dá)、耗竭谷胱甘肽等，活化 caspase－3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15］。

我們已經(jīng)報(bào)道了?；撬釋?duì)LIR后肺組織細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用［11］。其保護(hù)作用與其抗氧化效應(yīng)有關(guān)。但?；撬釋?duì)LIR后ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究中，TUNEL染色結(jié)果表明，與LIR組相比較，?；撬犷A(yù)處理組大鼠肺組織的細(xì)胞凋亡明顯減少，PaO2升高，肺組織中的MDA水平明顯降低，并且光鏡下結(jié)果也顯示肺損傷減輕。SOD和CAT在LIR組大鼠肺組織中明顯減少，?；撬崽幚斫M這些抗氧化酶活性增加，因此，認(rèn)為牛磺酸的保護(hù)作用與其抗氧化密切相關(guān)。

為了進(jìn)一步探討牛磺酸對(duì)大鼠LIR肺損傷時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響，我們研究了ERS相關(guān)基因XBP－1、ATF4和CHOP的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明:大鼠 LIR后肺組織中ATF4、XBP－1和CHOP mRNA表達(dá)上調(diào)，而?；撬犷A(yù)處理可使這些基因的表達(dá)下調(diào)。Western blotting結(jié)果也表明:牛磺酸能降低LIR后肺組織CHOP蛋白的表達(dá)，并且此時(shí)肺組織細(xì)胞凋亡減少，氧化應(yīng)激水平降低，肺呼吸功能改善。這些結(jié)果提示?；撬釋?duì)LIR后肺組織的保護(hù)作用與減輕ERS反應(yīng)有關(guān)。而且我們以前的研究發(fā)現(xiàn):LIR后肺組織B細(xì)胞淋巴瘤/白血病 －2(B cell lymphoma/leukemia－2 Bcl－2)表達(dá)下調(diào)，Bcl－2 相關(guān) X 蛋白(Bax)表達(dá)上調(diào)［16］，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示?；撬峥梢种芺ax基因表達(dá)的上調(diào)(結(jié)果未在文中顯示)。我們推測(cè)?；撬釡p少細(xì)胞凋亡的發(fā)生還可能與減輕ERS反應(yīng)，從而抑制某些促凋亡基因的表達(dá)有關(guān)。

總之，本研究表明，牛磺酸可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與牛磺酸下調(diào)LIR后肺組織ATF4和XBP－1的表達(dá)，降低促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP的水平有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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