肖 瑛， 方開(kāi)云， 石明雋， 劉瑞霞， 桂華珍， 郭 兵， 張國(guó)忠

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

有研究表明［1，2］，高糖狀態(tài)和糖尿病腎病時(shí)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白－7(bone morphogenetic protein－7，BMP－7)減少，給予外源性 BMP－7或轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)BMP－7可改善腎小管間質(zhì)纖維化，逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，減少腎小管上皮細(xì)胞的丟失，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞功能的恢復(fù)。但高糖通過(guò)何種途徑下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)BMP－7尚未見(jiàn)明確的報(bào)道。本課題組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示［3］，高糖環(huán)境可激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)并且p38MAPK可能介導(dǎo)了糖尿病時(shí)BMP－7表達(dá)的下調(diào)，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞活化，引起細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積。為進(jìn)一步證實(shí)p38MAPK是否確實(shí)參與高糖下調(diào)BMP－7的機(jī)制，我們進(jìn)行了以下研究。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠，重30－40 g，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma)，山羊抗大鼠BMP－7多克隆抗體、羊抗大鼠p38MAPK、pp38MAPK多克隆抗體、驢抗山羊 －HRP(Santa Cruz)，兔抗大鼠纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)多克隆抗體、抗CK18抗體、抗α－SMA抗體(武漢博士德公司)，UltraSensitiveTMSP超敏試劑盒(羊)(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，KIT－9709/9719)，培養(yǎng)細(xì)胞 RNA提取試劑盒、Taq PCR MasterMix、DNA MarkerⅠ(北京TIANGEN生物技術(shù)有限公司)，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas);p38MAPK特異性阻斷劑SB202190(Calbiochem);低糖DMEM(HyClone);胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco Introvagen)，D －glucose、D －mannitol(BBI)。

2 方法

2.1 大鼠原代腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 SD大鼠乙醚麻醉后無(wú)菌操作取出腎臟，去掉包膜和髓質(zhì)，留下皮質(zhì)剪碎后于80目篩網(wǎng)研磨，100目收集沉淀入離心管內(nèi)，0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min，1500 r/min離心10 min，含10%胎牛血清的DMEM終止消化，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)后以2×105細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁生長(zhǎng)的腎小管上皮細(xì)胞采用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA·Na2消化傳代，取3代細(xì)胞經(jīng)鑒定為腎小管上皮細(xì)胞后進(jìn)行下列分組實(shí)驗(yàn)，重復(fù)4次。

鑒定依據(jù)參照方開(kāi)云等［4］報(bào)道:(1)細(xì)胞生長(zhǎng)周期和形態(tài);(2)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)角蛋白18(CK18)陽(yáng)性和α－SMA陰性為腎小管上皮細(xì)胞。

2.2 原代腎小管上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至約80%時(shí)，換無(wú)血清含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步于靜止期。將細(xì)胞分為(1)正常對(duì)照組，用DMEM+10%FCS培養(yǎng);(2)高糖組，用20 mmol/L D－glucose+DMEM+10%FCS培養(yǎng);(3)SB202190處理組，用 SB20219020 μmol/L預(yù)處理細(xì)胞40 min，然后加入20 mmol/L D－glucose+DMEM+10%FCS培養(yǎng);(4)高滲組，用20 mmol/L D－mannitol+DMEM+10%FCS培養(yǎng)，72 h后收集細(xì)胞。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)BMP－7和FN的表達(dá) 于6孔板培養(yǎng)各組細(xì)胞72 h后，爬片經(jīng)PBS洗滌3次后用4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX－100打孔，采用SP法，分別加入BMP－7和FNⅠ抗(工作濃度均為1∶50)，4℃孵育過(guò)夜，PBS緩沖液替代Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。第2 dⅡ抗孵育，DAB顯色。

2.4 Western blotting檢測(cè)p38MAPK和p－p38MAPK蛋白水平 取培養(yǎng)瓶中每106個(gè)細(xì)胞加裂解液200 μL，4℃裂解30 min，離心取上清測(cè)定蛋白含量，經(jīng)SDS－PAGE垂直凝膠電泳后，300 mA電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBS洗膜后分別加抗 p38MAPK(1∶200)和 p－p38MAPK(1∶200)抗體4℃孵育過(guò)夜;加Ⅱ抗室溫孵育2h，ECL試劑曝光。用抗體剝脫液剝脫抗體后，按同樣的方法與抗β－actin抗體(1∶300)孵育。凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。以β－actin蛋白條帶作內(nèi)參照，結(jié)果用靶蛋白/β－actin比值表示。

2.5 RT－PCR檢測(cè)BMP－7和FN mRNA水平 用Trizol試劑提取腎小管上皮細(xì)胞總RNA，核酸蛋白分析儀檢測(cè)含量。0.5 μg總RNA以O(shè)ligo(dT)18primer為反轉(zhuǎn)錄引物，合成cDNA。以cDNA為模板按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進(jìn)行RT－PCR。引物自行設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。BMP－7引物序列為:上游 5'－GCACCTCCAGGGAAAAC －3'，下游 5'－AAGCCCAGATGGTACGG－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為451 bp;β－actin引物序列為:上游5'－TGGCATTGTGATGGACTC －3'，下游5'－CCGATAGTGATGACCTGAC－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為306 bp;PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃ 45 s，56.3℃ 30 s，72℃45 s，40個(gè)循環(huán)后充分延伸10 min。FN引物序列為:上游5'－GGACACTATGCGGGTCACTT－3'，下游 5'－TCAAAACCAGTTGGGGAGTC －3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 291bp;β－actin引物序列為:上游 5'－GAAATCGTGCGTGACATTAAG －3'，下游 5'－CTAGAAGCATTTGCGGTGGA－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為490 bp;PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min，94℃30 s，54.2℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)后充分延伸10 min。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并用ChmioDox軟件分析圖像，PCR產(chǎn)物量以吸光度值×面積表示，與β－actin比值表示BMP－7和FN的相對(duì)含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 腎小管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況及鑒定

細(xì)胞的生長(zhǎng)從培養(yǎng)48 h開(kāi)始，腎小管節(jié)段周圍可見(jiàn)卵圓形上皮樣細(xì)胞長(zhǎng)出，圍繞腎小管呈島嶼狀向四周逐漸增大，見(jiàn)圖1。第5－6 d基本鋪滿培養(yǎng)瓶底部，細(xì)胞形態(tài)為多邊鵝卵石樣，體積較大、鏡下透明度及折光性強(qiáng)，各細(xì)胞互相緊密相靠，可見(jiàn)融合成片及復(fù)層生長(zhǎng)。經(jīng)胰酶消化傳代后，腎小管上皮細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞貼壁并呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，符合上皮細(xì)胞生長(zhǎng)特性。

細(xì)胞爬片行免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，CK18均呈棕黃色、α－SMA未見(jiàn)陽(yáng)性染色表示其為腎小管上皮細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

2 免疫細(xì)胞化學(xué)顯示BMP－7和FN蛋白的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)顯示，BMP－7主要表達(dá)于對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞胞漿，高糖組BMP－7的表達(dá)顯著減少，SB202190處理組表達(dá)則較高糖組明顯增多，與高滲組比較無(wú)顯著差異。對(duì)照組有少量FN蛋白表達(dá)，高糖組較對(duì)照組顯著升高，SB202190處理組與高糖組比較顯著減少，高滲組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3。

Figure 1.Morphology of primary renal tubular epithelial cells(3 rd day of incubation，×200).圖1 原代培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞活體觀察

Figure 2.The expression of CK18 and α － SMA proteins in primary renal tubular epithelial cells(SABC，×400).A:CK18;B:α －SMA.圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)顯示CK18和α－SMA在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)

Figure 3.Immunocytochemistry shows the expression of BMP－7 and FN protein in primary renal tubular epithelial cells from control(A)，high glucose(B)，SB202190－treated(C)and D－mannitol(D)groups(SABC，×400).圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)顯示BMP－7和FN在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

3 Western blotting顯示p38MAPK和p－p38MAPK蛋白表達(dá)

Western blotting結(jié)果顯示在培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞，對(duì)照組有少量 p38MAPK表達(dá)，p－p38MAPK基本沒(méi)有表達(dá)。高糖刺激72 h后，總p38MAPK和p－p38MAPK蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，SB202190處理組總p38MAPK的變化不大，而pp38MAPK的表達(dá)卻顯著降低，較高糖組減少約80%(P＜0.05)，表明 SB202190能有效抑制 p38MAPK磷酸化，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The levels of p38MAPK(A)and p－p38MAPK(B)proteins in primary renal tubular epithelial cells by Western blotting.1:control;2:mannitol;3:high glucose;4:SB202190+high glucose..n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs high glucose group.圖4 Western blotting檢測(cè)p38MAPK(A)和p－p38MAPK(B)蛋白在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

4 RT－PCR顯示BMP－7和FN的mRNA水平

在正常糖濃度培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中BMP－7 mRNA水平較高，與在高滲環(huán)境中無(wú)差異，高糖組其轉(zhuǎn)錄水平下降約100%，而SB202190處理組BMP－7 mRNA水平顯著提高，甚至超過(guò)正常對(duì)照組。而FN在正常糖濃度與高滲環(huán)境中轉(zhuǎn)錄水平很低，高糖組轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，而SB202190處理組FN mRNA明顯減少，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The levels of BMP －7 and FN mRNAs in primary renal tubular epithelial cells.1:control;2:mannitol;3:high glucose;4:SB202190+high glucose..n=4.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs high glucose group.圖5 BMP－7和FN mRNA在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)

討 論

有研究發(fā)現(xiàn)在腎臟發(fā)育過(guò)程中，BMP－7能促使輸尿管芽形成和腎臟上皮細(xì)胞從間充質(zhì)細(xì)胞分化從而形成正常腎組織。而腎臟疾病時(shí)，BMP－7可以上調(diào)上皮細(xì)胞表型的標(biāo)志物E－鈣黏素的表達(dá)，從而抑制EMT以維持正常腎臟細(xì)胞表型;減少上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而減輕纖維化;抑制促炎癥因子的釋放，減少炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕間質(zhì)纖維化;能夠拮抗TGF－β1的致腎纖維化作用而發(fā)揮其抑制腎纖維化的作用;促進(jìn)ECM的降解;因此BMP－7已被證實(shí)在調(diào)節(jié)和控制腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化中扮演重要角色［5］。DN時(shí)腎組織 BMP－7表達(dá)減少，外源性給予或促進(jìn)內(nèi)源性BMP－7恢復(fù)可保護(hù)甚至逆轉(zhuǎn)DN腎功能和病理改變，且BMP－7作為一種內(nèi)源性分子，作為藥物治療DN其毒性幾乎為零［6］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)［3，7］，STZ 誘導(dǎo)的 DM大鼠模型隨病程延長(zhǎng)腎皮質(zhì)BMP－7的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著減少，與腎小管間質(zhì)損害程度呈顯著負(fù)相關(guān)，使用胰島素或中藥丹芪合劑在促進(jìn)內(nèi)源性BMP－7表達(dá)恢復(fù)的同時(shí)ECM沉積和腎小管間質(zhì)損害程度被顯著減輕。由于目前研究BMP－7多在細(xì)胞株培養(yǎng)，而在原代腎小管上皮細(xì)胞加入高糖培養(yǎng)的研究較少，故本實(shí)驗(yàn)觀察了從大鼠腎皮質(zhì)提取腎小管節(jié)段進(jìn)行原代腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)，傳至3代后靜止24 h加入20 mmol/L D－glucose孵育，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，BMP－7的表達(dá)也是逐漸減少的，至72 h后其mRNA表達(dá)幾乎缺失，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)變化是一致的。

p38MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)分子家族，該信號(hào)分子可被磷酸化為p－p38MAPK而激活，完成由胞漿移位至胞核的核轉(zhuǎn)位過(guò)程，進(jìn)而調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄［8，9］。我們體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察到從DM 2周開(kāi)始p－p38MAPK胞核陽(yáng)性染色，8周組達(dá)高峰，此后一直維持在高水平。BMP－7mRNA的減少與pp38MAPK增多平行，并且 BMP－7蛋白與 pp38MAPK表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示了DM腎小管上皮細(xì)胞p38MAPK與BMP－7之間可能存在相互調(diào)節(jié)關(guān)系［3］。這與 Motazed等［10］在人近曲小管上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)相一致。但是這并不能確切表明p38MAPK可作為BMP－7的上游信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)。為了進(jìn)一步觀察p38MAPK是否參與高糖下調(diào)BMP－7的表達(dá)，我們?cè)谠囵B(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中加入高糖共同孵育的研究來(lái)進(jìn)行觀察。研究發(fā)現(xiàn)在正常糖培養(yǎng)環(huán)境下，腎小管上皮細(xì)胞BMP－7蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平均較高，有少量總p38MAPK表達(dá)，但未見(jiàn)活化的p38MAPK;高糖刺激72 h后，總p38MAPK和p－p38MAPK蛋白表達(dá)明顯增加，p－p38MAPK增加尤為明顯，而B(niǎo)MP－7蛋白和mRNA的表達(dá)卻顯著減少，F(xiàn)N蛋白和mRNA的表達(dá)也顯著增多;在高糖環(huán)境中應(yīng)用p38MAPK特異性阻斷劑SB202190處理 72 h后，總 p38MAPK的變化不大，而 pp38MAPK的表達(dá)卻顯著降低，較高糖組減少約80%，同時(shí)BMP－7蛋白和mRNA的表達(dá)卻由此明顯增多，說(shuō)明該抑制劑減少了活化的p38MAPK，這可能解除了對(duì)BMP－7的抑制作用而使內(nèi)源性BMP－7的表達(dá)恢復(fù)且伴隨FN的沉積減少，提示p38MAPK信號(hào)通路參與介導(dǎo)高糖刺激下腎小管上皮細(xì)胞BMP－7表達(dá)下調(diào)，阻斷此信號(hào)通路可引起內(nèi)源性BMP－7表達(dá)上調(diào)，從而使細(xì)胞外基質(zhì)FN減少。這與在軟骨細(xì)胞的研究［11］一致。

通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，雖然發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號(hào)通路可能參與介導(dǎo)HG刺激腎小管上皮細(xì)胞BMP－7表達(dá)的下調(diào)，得到p38MAPK可作為BMP－7的上游信號(hào)，參與調(diào)節(jié)BMP－7的作用。但是p－p38MAPK是如何調(diào)節(jié)BMP－7的還不清楚，其作用環(huán)節(jié)有待進(jìn)一步研究。

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