劉瑞霞， 郭 兵， 肖 瑛， 石明雋， 王圓圓， 桂華珍， 張國(guó)忠

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

近年來(lái)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1(transforming growth factor－β1，TGF－β1)/Smad信號(hào)在組織纖維化調(diào)控機(jī)制中的重要作用逐漸被認(rèn)識(shí)［1］。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN(Ski－related novel protein N)是該信號(hào)通路的重要負(fù)性調(diào)控因子，可嚴(yán)格調(diào)控TGF－β1/Smad信號(hào)的活性。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)病的前8周SnoN蛋白表達(dá)減少［2］，但有關(guān)SnoN蛋白和mRNA隨DN病程延長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況及SnoN蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2(Smad ubiquitin regulatory factor 2，Smurf 2)是一種E3泛素連接酶，它通過(guò)介導(dǎo)Smad信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子SnoN和Smad7蛋白的降解，在TGF－β1/Smad信號(hào)的調(diào)節(jié)中起著重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，在梗阻性(unilateral ureteral obstruction，UUO)腎纖維化模型中Smurf 2的表達(dá)與SnoN蛋白降解之間存在著密切的相關(guān)性［3］。但有關(guān)DN腎纖維化發(fā)生發(fā)展中Smurf 2的表達(dá)情況及其是否參與了SnoN蛋白的泛素化降解過(guò)程，尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究動(dòng)態(tài)觀察了DN發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Smurf 2蛋白和mRNA的表達(dá)情況，并初步探討其與SnoN蛋白降解的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(Sigma);SnoN和Smurf 2兔多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology);磷酸化Smad2(p－Smad2)Ⅰ抗(Cell Signaling Technology);TGF－β1兔多克隆抗體和β－actin小鼠單克隆抗體，SABC－FITC試劑盒及生物素標(biāo)記的鼠抗IgG、兔抗IgG(博士德公司);胰島素兔多克隆抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司);ECL顯色劑(Pierce Biotechnology);總RNA提取試劑盒(Trizol法)、2×Taq PCR MasterMix及DNA MarkerⅠ(天根生化科技有限公司);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(MBI Fermentas);Smurf 2、SnoN及 β－actin引物(上海生工合成)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型及分組 健康清潔級(jí)雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠［上海西普爾－比凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為 SCXY(滬)2003－0002］，體重(180±20)g。按55 mg/kg STZ尾靜脈注射復(fù)制DM大鼠模型，48 h后測(cè)空腹血糖，血糖值≥16.7 mmol/L且尿糖陽(yáng)性者作為糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠，隨機(jī)分成 DM 2、4、8、12、16 和 24 周組，每一時(shí)點(diǎn)均設(shè)鼠齡匹配的正常對(duì)照組(n=6)。各組大鼠均予自來(lái)水、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，并在每個(gè)時(shí)點(diǎn)處死動(dòng)物。于處死前1 d稱體重，代謝籠收集24 h尿液，記錄尿量。股動(dòng)脈取血收集血清，－20℃保存;處死大鼠，取胰腺和腎組織，稱腎重，于4%多聚甲醛固定和－80℃保存。以腎重(mg)與體重(g)比值作為腎臟指數(shù)。

2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)尿蛋白，氧化酶(glucose oxidase－peroxidase，GOD －PAP)法測(cè)血清葡萄糖，苦味酸法測(cè)血清肌酐，均按試劑說(shuō)明書(shū)操作。

2.3 組織病理觀察 將多聚甲醛固定的胰腺和腎組織制成3 μL厚石蠟切片，行HE染色和免疫熒光SABC法觀察各組胰腺組織胰島素(Ⅰ抗?jié)舛葹?∶200)的表達(dá)，光鏡下觀察胰腺和腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

2.4 免疫熒光檢測(cè)SnoN和Smurf 2蛋白的表達(dá)部位 石蠟切片行免疫熒光SABC法檢測(cè)，SnoN和Smurf 2蛋白Ⅰ抗?jié)舛染鶠?∶100，陰性對(duì)照用PBS代替Ⅰ抗。用LEICA DMLS型熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

2.5 免疫印跡檢測(cè) SnoN、Smurf 2、TGF－β1及 p－Smad2蛋白表達(dá)量 以組織裂解液提取腎皮質(zhì)總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)提取蛋白濃度。每泳道40 μg蛋白上樣，行SDS－PAGE垂直電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。TBST沖洗，脫脂奶粉封閉。然后將膜放入稀釋的Ⅰ抗(SnoN、Smurf 2、TGF －β1、p－Smad2、β －actin稀釋倍數(shù)分別為 1∶400、1∶200、1∶100、1∶800、1∶400)，4℃過(guò)夜。第2 d，TBST沖洗后，將膜放入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(稀釋倍數(shù)均為1∶9000)，室溫孵育2 h，TBST沖洗后 ECL顯影曝光。Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件分析各陽(yáng)性條帶的積分灰度值，設(shè)內(nèi)參照β－actin，計(jì)算各目標(biāo)蛋白的相對(duì)含量。

2.6 RT－PCR檢測(cè)Smurf 2和SnoN mRNA的表達(dá)取約50 mg腎皮質(zhì)，Trizol法提取總RNA，核酸蛋白儀測(cè)RNA濃度和純度(260 nm/280 nm比值均在1.8－2.0之間)。引物序列如下:Smurf 2正義鏈5'－GGGAACGCCCAACAAGAC－3'，反義鏈 5'－ATT-GCGGATCTCCCACCC －3'，產(chǎn)物306 bp，相應(yīng) β －actin正義鏈 5'－GAAATCGTGCGTGACATTAAG－3'，反義鏈5'－CTAGAAGCATTTGCGGTGGA －3'，產(chǎn)物490 bp;SnoN正義鏈5'－GAAAACCTCCAGTCTAAGTTCTCCTTAGTT－3'，反義鏈 5'－ATGAAGCTGGTCTGAAGTACACCTTGAACA － 3'，產(chǎn)物 500 bp;相應(yīng)β－actin正義鏈5'－TGGCATTGTGATGGACTC－3'，反義鏈 5'－ CCGATAGTGATGACCTGAC －3'，產(chǎn)物306 bp。取5 μg腎組織總RNA配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄條件70℃ 5 min、37℃ 5 min，置冰上加入M －MULV 1 μL，42 ℃ 60 min，合成 cDNA，放 －20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，Smurf 2和490 bp β－actin引物54.5℃退 火 45 s，SnoN 和 306 bp β －actin引 物58.3℃退火45s，72℃延伸1min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Bio－Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，Quantity One軟件分析各條帶積分吸光度值，Smurf 2和SnoN mRNA的相對(duì)量分別用 Smurf 2/β －actin、SnoN/β －actin的積分吸光度值表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。單因素方差分析對(duì)多組均數(shù)做顯著性檢驗(yàn)，組間比較用q檢驗(yàn)。Bivariate Correlations進(jìn)行相關(guān)性分析。

結(jié) 果

1 血糖、血肌酐、24 h尿蛋白和腎臟指數(shù)

DM組各時(shí)點(diǎn)的血糖、血肌酐(Scr)、24 h尿蛋白、腎臟指數(shù)均顯著高于對(duì)照組，見(jiàn)表1。

表1 正常和糖尿病各組血糖、血肌酐、24 h尿蛋白量及腎臟指數(shù)的變化Table 1.Changes of blood glucose，Scr，24 h urine protein and kidney index in normal control(C)and diabetes(DM)groups(.n=6)

表1 正常和糖尿病各組血糖、血肌酐、24 h尿蛋白量及腎臟指數(shù)的變化Table 1.Changes of blood glucose，Scr，24 h urine protein and kidney index in normal control(C)and diabetes(DM)groups(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs Control group.

Group Blood glucose(mmol/L) Scr(μmol/L) 24 h urine protein(mg) Kidney index(mg/g)2 weeks C 6.72 ±2.42 58.86 ±7.40 2.01 ±1.21 7.11±0.48 DM 20.42 ±5.11＊＊ 71.37 ±7.62* 22.36 ±8.91＊＊ 11.27 ±0.58*4 weeks C 7.61 ±0.55 53.21 ±3.21 5.28 ±2.31 7.23 ±0.58 DM 24.07 ±3.52＊＊ 72.55 ±5.36* 32.30 ±8.35＊＊ 12.02 ±0.83＊＊8 weeks C 7.89 ±1.34 54.93 ±7.59 7.73 ±1.22 5.91 ±0.41 DM 26.36 ±2.02＊＊ 99.23 ±12.11＊＊ 27.26 ±8.51＊＊ 13.21 ±1.59＊＊12 weeks C 7.00 ±0.71 51.14 ±10.43 3.41 ±1.71 5.69 ±0.52 DM 23.43 ±2.56＊＊ 97.80 ±21.87＊＊ 22.10 ±7.31＊＊ 12.59 ±2.46＊＊16 weeks C 8.04 ±0.32 73.46 ±12.68 6.65 ±1.24 5.64 ±0.26 DM 27.15 ±1.20＊＊ 118.07 ±11.88＊＊ 26.38 ±18.34＊＊ 10.39 ±0.79＊＊24 weeks C 7.95 ±1.09 89.72 ±8.13 3.76 ±1.19 5.63 ±0.38 DM 23.33 ±2.63＊＊ 116.37 ±38.28＊＊ 49.35 ±31.86＊＊ 10.27 ±0.93＊＊

2 胰腺形態(tài)學(xué)觀察

HE染色顯微鏡下觀察正常大鼠胰島呈圓形或橢圓形的細(xì)胞團(tuán)，各DM組胰島數(shù)量明顯減少，殘存的胰島成萎縮狀，胰島細(xì)胞數(shù)量減少，見(jiàn)圖1。免疫熒光染色可見(jiàn)正常大鼠胰腺組織胰島素表達(dá)較強(qiáng)，DM組胰島素表達(dá)明顯減弱，見(jiàn)圖2。

Figure 1.Histological changes of pancreas in control and diabetic rats(hematoxylin and eosin staining(×400).A:control group;B:diabetic group.圖1 正常對(duì)照組和糖尿病組大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)

Figure 2.Expression of insulin in the pancreas in control and diabetic rats(SABC －FITC，×400).A:control group;B:diabetic group.圖2 正常對(duì)照組和糖尿病組大鼠胰腺胰島素的表達(dá)

3 腎組織病理變化

HE染色可見(jiàn)正常大鼠腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜完整，間質(zhì)中未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。DM 4周組即可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞變性，部分腎小管管腔擴(kuò)張，間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，且隨病程進(jìn)展病變逐漸加重，見(jiàn)圖3。

4 免疫熒光

圖4可見(jiàn)，SnoN和Smurf 2蛋白在大鼠腎組織中主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)細(xì)胞。

Figure 3.Histological changes of kidney in control and diabetic rats(hematoxylin and eosin staining，×400).A:control group;B:diabetic group.圖3 正常對(duì)照組和糖尿病組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)

Figure 4.Expression of SnoN and Smurf 2 protein in the kidney of rats(SABC－FITC，×400).A:negative control;B:SnoN;C:Smurf 2.圖4 SnoN和Smurf 2蛋白在大鼠腎組織的表達(dá)

5 免疫印跡結(jié)果

正常組及DM組每個(gè)時(shí)點(diǎn)各取6只大鼠的Western blotting結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以內(nèi)參β－actin校正后，DM 2周SnoN蛋白的表達(dá)與正常組相比無(wú)差異，DM 4周起表達(dá)明顯減少，DM 12周組表達(dá)最少，為正常組的50.70%，之后持續(xù)在較低水平，見(jiàn)圖5。

Smurf 2和p－Smad2蛋白在正常組有少量表達(dá)，DM 2周組表達(dá)即明顯增多，并隨病程進(jìn)展逐漸增多，DM 12周表達(dá)最多，之后持續(xù)在較高水平，見(jiàn)圖5。

對(duì)42只大鼠腎皮質(zhì)中SnoN和Smurf 2蛋白的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示:r=－0.88，P＜0.01，可見(jiàn)，SnoN和Smurf 2蛋白的表達(dá)量高度負(fù)相關(guān)。

Figure 5.The levels of SnoN，Smurf 2，TGF－β1and p－Smad2 protein in kidney of control and DM rats.A:Western blotting analysis of renal SnoN，Smurf 2，TGF － β1and p－Smad2.Representative Western blotting show one animal per time point.B:graphical presentations show the relative abundance of SnoN，Smurf 2，TGF － β1and p－Smad2 at different time points after normalization with β－actin..n=6.*P＜0.05，#P＜0.01 vs control group.圖5 蛋白印跡顯示正常組及糖尿病各組SnoN、TGF－β1及Smad2/3的表達(dá)

與正常組相比，DM 2周組TGF－β1蛋白表達(dá)即明顯增多，并隨病程進(jìn)展表達(dá)逐漸增多，見(jiàn)圖5。

6 RT－PCR結(jié)果

圖6所示，對(duì)照組大鼠腎皮質(zhì)可檢測(cè)到Smurf 2 mRNA表達(dá)，DM 4周組起表達(dá)較對(duì)照組顯著增多(P＜0.01)，且隨病程延長(zhǎng)而遞增。各DM組與正常對(duì)照組相比，SnoN mRNA的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

討 論

本研究用STZ成功復(fù)制了大鼠DM模型。胰島病理觀察可見(jiàn)DM大鼠胰島縮小，β細(xì)胞數(shù)量減少，胰島素分泌減少，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間大鼠血糖持續(xù)在高水平。從DM 2周起大鼠血肌酐和24 h尿蛋白增高并出現(xiàn)了腎臟病理改變，表明并發(fā)了DN。

Figure 6.SnoN and Smurf 2 mRNA levels in kidney from rats in different groups.A:RT－PCR analysis displays little change in SnoN mRNA levels in the DM kidneys after streptozotocin injectin.B:RT － PCR analysis shows the induction of Smurf 2 mRNA expression in the DM kidneys after streptozotocin injectin in a time－dependent manner.Representative RT － PCR bands show one animal per time point.C:graphical presentations show the relative abundance of SnoN and Smurf 2 mRNA abundance after normalization with β － actin..n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.圖6 各組大鼠腎組織中SnoN和Smurf 2 mRNA的水平

TGF－β1作為DN多種致病因素的交匯點(diǎn)，可通過(guò)其下游Smads信號(hào)蛋白調(diào)控腎小管－間質(zhì)纖維化發(fā)病過(guò)程，在DN進(jìn)行性發(fā)展中發(fā)揮重要作用。核轉(zhuǎn)錄共抑制因子SnoN是TGF－β1/Smad信號(hào)通路中重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中它可以通過(guò)不同的機(jī)制阻斷TGF－β1/Smad信號(hào)通路的信息傳遞［4－6］。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，DM發(fā)病的前8周，隨病程進(jìn)展腎組織SnoN蛋白表達(dá)減少［2］。本研究持續(xù)觀察至DM 24周，發(fā)現(xiàn)DM 8周后，DM各組SnoN蛋白的表達(dá)仍明顯少于正常對(duì)照組;而DM各組SnoN mRNA的表達(dá)量與正常對(duì)照組相比均無(wú)差異;提示SnoN蛋白的表達(dá)減少可能參與了DN的發(fā)病過(guò)程，但它的表達(dá)減少并不是由其基因轉(zhuǎn)錄改變引起的。近期有研究發(fā)現(xiàn)SnoN蛋白的表達(dá)減少在UUO所致腎纖維化的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，且Smurf 2介導(dǎo)的泛素化降解與SnoN蛋白的表達(dá)減少密切相關(guān)，提示泛素化降解SnoN增加可能是導(dǎo)致腎纖維化的重要原因［7］。

泛素－蛋白酶體依賴性途徑介導(dǎo)的蛋白水解系統(tǒng)是由一系列高度組織的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)組成，主要包括泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)三類酶［8，9］。其中，由于 E3 連接酶決定了降解底物蛋白的特異性和選擇性，因此在泛素－蛋白酶體途徑中起著決定性作用［9］。Smurf 2是一種HECT(與E6－AP羧基端同源)型E3連接酶，由1個(gè)氨基末端可與磷脂/鈣結(jié)合的C2結(jié)構(gòu)域、3個(gè)WW結(jié)構(gòu)域和1個(gè)羧基末端的HECT連接酶結(jié)構(gòu)域組成，它與 TGF－β1/Smad信號(hào)通路中的 SnoN、Smad7和Smad2等蛋白的降解均有關(guān)［10］。目前有關(guān)泛素－蛋白酶體在DM并發(fā)癥發(fā)病中的研究尚少，偶有報(bào)道其與DM神經(jīng)病變和視網(wǎng)膜病變的發(fā)病有關(guān)［11］。

本研究顯示，在正常大鼠腎組織中有少量Smurf 2蛋白的表達(dá)，DM 2周時(shí)表達(dá)已明顯增多，并隨病程進(jìn)展逐漸增加，DM 12周達(dá)最高，之后持續(xù)在較高水平。Tan等［6］研究亦發(fā)現(xiàn)，在糖尿病伴局灶節(jié)段性腎小球硬化病人腎組織中Smurf 2蛋白表達(dá)增加，但其作用及原因未明，提示Smurf 2蛋白的表達(dá)變化可能參與了DN的發(fā)病過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化的Smad2通過(guò)其氨基端和連接區(qū)的PPXY結(jié)構(gòu)與Smurf 2的WW結(jié)構(gòu)域相互作用，可介導(dǎo)SnoN蛋白的泛素化降解［12］。本研究還觀察到，DN發(fā)病過(guò)程中TGF－β1表達(dá)增多，被它磷酸化的Smad2也相應(yīng)增加，且磷酸化Smad2和Smurf 2蛋白的增多均早于SnoN蛋白的減少，并且Smurf 2和SnoN蛋白的表達(dá)量呈高度負(fù)相關(guān)，且二者表達(dá)部位一致，主要表達(dá)于腎小管上皮及腎小管間質(zhì)細(xì)胞。以上結(jié)果提示，在DN發(fā)病過(guò)程中SnoN蛋白表達(dá)減少可能與Smurf 2介導(dǎo)其泛素化降解有關(guān)，表達(dá)增多的Smurf 2可能通過(guò)降解TGF－β1/Smad信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)控因子SnoN，在DN腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。

雖然泛素－蛋白酶體依賴型降解途徑在許多生理學(xué)功能中均發(fā)揮作用，E3連接酶Smurf 2的生物學(xué)功能除了可降解TGF－β1/Smad信號(hào)通路中的SnoN蛋白，還與Smad 7、Smad 2和β－catenin等蛋白的降解有關(guān)。但近期的研究表明，在UUO所致腎纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展中，Smurf 2的最終作用是增強(qiáng)TGF－β1/Smad信號(hào)通路的活性，且TGF－β1可通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路刺激 Smurf 2的表達(dá)［13］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，隨著DN病程進(jìn)展Smurf 2 mRNA表達(dá)增多，這是否與PI3K/AKT通路激活有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

［1］戴 晴，李 欣，鄭 磊，等.丹參素對(duì)肝星狀細(xì)胞TGF－β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2009，25(10):1988－1994.

［2］劉瑞霞，郭 兵，崔 龍，等.SnoN蛋白在糖尿病大鼠腎組織中的表達(dá)及其意義［J］.中國(guó)病理生理雜志，2008，24(6):1188－1192.

［3］Tan RL，Zhang JL，Tan XY，et al.Downregulation of SnoN expression in obstructive nephropathy is mediated by an enhanced ubiquitin － dependent degradation［J］.Am Soc Nephrol，2006，17(10):2781 －2791.

［4］Liu X，Sun Y，Weinberg RA，et al.Ski/Sno and TGF －beta signaling［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2001，12(1):1－8.

［5］Reed JA，Lin Q，Chen D，et al.SKI pathways inducing progression of human melanoma［J］.Cancer Metastasis Rev，2005，24(2):265－272.

［6］Tan RY，He WC，Lin X，et al.Smad ubiquitination regulatory factor－2 in the fibrotic kidney:regulation，target specificity，and functional implication［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2008，294(5):F1076 － F1083.

［7］Debigaré R，Price SR.Proteolysis，the ubiquitin－proteasome system，and renal diseases［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2003，285(1):F1 － F8.

［8］Mani A，Gelmann EP.The ubiquitin－proteasome pathway and its role in cancer［J］.J Clin Oncol，2005，23(21):4776－4789.

［9］Inoue Y，Imamura T.Regulation of TGF－beta family signaling by E3 ubiquitin ligases［J］.Cancer Sci，2008，99(11):2107－2112.

［10］Akarsu E，Pifim I，Capogh I，et a1.Relationship between electroneurographic changes and serum ubiquitin levels in patients with type 2 diabetes［J］.Diabetes Care，2001，24(1):1－3.

［11］Adachi－Uehara N，Kato M，Nimura Y，et a1.Up－regulation of genes for oxidative phosphorylation and protein turnover in diabetic mouse retina［J］.Exp Eye Res，2006，83(4):849－857.

［12］Bonni S，Wang HR，Causing CG，et al.TGF－beta induces assembly of a Smad2－Smurf 2 ubiquitin ligase complex that targets SnoN for degradation［J］.Nat Cell Biol，2001，3(6):587－595.

［13］Ohashi N，Yamamoto T，Uchida C，et al.Transcriptional induction of Smurf 2 ubiquitin ligase by TGF － beta［J］.FEBS Lett，2005，579(12):2557 －2563.