宋瑋, 陳佳, 張英, 任麗麗, 米芋枚, 路巖, 姜一農(nóng)
(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科,遼寧 大連 116027)
Nguyen等[1]于2002年首次報(bào)道在腎系膜細(xì)胞克隆出了腎素(前體)受體,迄今為止已克隆出了2種受體。其中6磷酸甘露糖/胰島素樣生長因子Ⅱ受體[mannose-6-phosphate/insulin like growth fac-torⅡ(IGFⅡ)receptor,M6P/IGF2R]被認(rèn)為是prorenin的清除機(jī)制。Prorenin與之結(jié)合后產(chǎn)生一種內(nèi)化效應(yīng)被降解,M6P/IGF2R決定了細(xì)胞外prorenin的水平[1]。另一種是功能型的受體腎素(前體)受體[(pro)renin receptor,(P)RR],這種受體是含有350個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),具有1個(gè)跨膜區(qū)域,與其它的已知蛋白沒有同源性,在物種之間有高度保守性[1]。Nguyen最初以免疫熒光方法觀察到(P)RR存在于腎系膜細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈和腎動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中,目前認(rèn)為在心臟、腎臟、腦和胎盤組織(P)RR mRNA均以高水平表達(dá)[2]。(P)RR過度激活后參與激活細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,上調(diào)一些基因表達(dá),同時(shí)增強(qiáng)(pro)renin的酶活性[3]。隨著人們對(duì)RAS系統(tǒng)的深入研究,(P)RR已經(jīng)成為伴有RAS系統(tǒng)過度激活相關(guān)腎病的熱點(diǎn)問題之一。
Prorenin的前肽片段包含一控制區(qū)域(handle region),此控制區(qū)域是與受體結(jié)合的部位。人們依據(jù)prorenin前肽片段與受體結(jié)合的關(guān)鍵部位的氨基酸序列,設(shè)計(jì)出了1個(gè)肽片段,利用生物技術(shù)合成了十肽片段HRP(handle region peptide)。HRP模仿控制區(qū)域的序列,競爭性與受體結(jié)合[4],故被認(rèn)為是(P)RR的阻斷劑,但目前還沒有確切的證據(jù)證明。
(P)RR在物種間具有高度保守性[1],目前雖然已有許多動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明(P)RR在心肌纖維化、腎小球硬化中發(fā)揮著獨(dú)立的病理作用,但尚無(P)RR在人類各臟器致病作用的報(bào)道。腎系膜細(xì)胞(human renal mesangial cells,HRMCs)增殖是高血壓腎病和糖尿病腎病的共同特點(diǎn),其增殖和內(nèi)分泌功能在高血壓腎病和糖尿病腎病發(fā)展中起著重要的作用。本研究旨在觀察prorenin對(duì)體外培養(yǎng)的人腎系膜細(xì)胞ERK 1/2信號(hào)通道的活化作用及促纖維化因子轉(zhuǎn)化生長因子(transfer growth factor-β,TGF-β)表達(dá)的影響,并通過p-ERK 1/2和TGF-β的水平研究HRP是否具有(P)RR的阻斷作用。
Prorenin購自Sigma。HRMCs及MCM培養(yǎng)液購自ScienCell。TGF-β ELISA試劑盒購自武漢博士德有限公司。細(xì)胞總RNA提取試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司。TGF-β PCR試劑盒及引物購自中國大連TaKaRa生物工程有限公司。兔抗人p-ERK、ERK抗體,羊抗兔-HRP抗體購自Santa Cruz。
按照HRMCs說明書培養(yǎng)于MCM培養(yǎng)液,培養(yǎng)條件37℃、5%CO2。細(xì)胞長至80% -90%,棄培養(yǎng)液,加入0.025%胰蛋白酶37℃消化1-2 min,顯微鏡下觀察,大部分細(xì)胞變圓近脫壁時(shí),加入含10%FBS的培養(yǎng)液終止反應(yīng),收集細(xì)胞懸液至離心管中,1000 r/min離心5 min。棄上清,加入MCM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)后接種至新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),取3-6代實(shí)驗(yàn)用。
采用雙抗體夾心ELISA法。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入包被TGF-β單抗的酶標(biāo)板上,按試劑盒操作。反應(yīng)終止后,在492 nm處測(cè)A值,TGF-β濃度與A值成正比,可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中TGF-β濃度。
采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法。
4.1 細(xì)胞 RNA抽提 按照 Trizol說明書提取HRMCs的總RNA,溶于20 μL DEPC水中,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/280比值(為1.8-2.0),測(cè)定濃度后保存于-70℃。
4.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) RNA 樣品1 μg、100 mg/L Oligo(dT)18.2 μL,加 DEPC 水至 10 μL,80 ℃ 加熱變性5 min。取出置冰上,再加入M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U、5 × 緩沖液 4 μL、10 mmol/L dNTPmix 2 μL、RNA酶抑制劑20 U,補(bǔ)DEPC水至20 μL,將上面2個(gè)步驟的液體混勻,37℃反應(yīng)1 h;95℃反應(yīng)3 min。將所有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃ 保存。
4.3 PCR 擴(kuò)增反應(yīng) cDNA 2 μL、Taq 酶 1 μL、dNTP(10 mmol/L)1.5 μL、MgCl2(25 mmol/L)3.6 μL、10×PCR 緩沖液 3 μL、TGF- β 或 β -actin上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL,補(bǔ)三蒸水至 25 μL。PCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性94℃ 2 min;94℃45 s、72 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min,循環(huán) 20次;72 ℃7 min。用β-actin作為內(nèi)參照。人TGF-β:上游引物5'- GCATGGAGTOCTGTGGCAT -3',下游引物5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGG -3';β -actin上游引物5'-CCGCAAGGACCTCGGCTGGAA -3',下游引物5'-GATCATGTTGGACAGCGCTC -3'。
4.4 cDNA電泳 所有PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳,凝膠成像系統(tǒng)掃描,軟件分析,并計(jì)算目的基因/β-actin吸光度(A)的比值。
用Western blotting方法檢測(cè)。
5.1 總蛋白提取及濃度測(cè)定 用預(yù)冷的PBS液輕洗細(xì)胞3次后加入2×SDS凝膠加樣緩沖液,搖床上搖動(dòng)15 min,用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞殘片后將其轉(zhuǎn)移至EP管中,冰上孵育15 min,置于沸水中煮沸約5 min。將蛋白裂解液4℃、12000 r/min離心10 min,上清分裝至EP管中,按照BCA法測(cè)定蛋白濃度。
5.2 Western blotting 蛋白上樣 40 μg,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,蛋白條帶轉(zhuǎn)到PVDF膜上,5%脫脂奶粉 TBS-T溶液(20 mmol/L Tris、137 mmol/L NaCl、0.1%Tween-20)用于封閉和稀釋Ⅰ抗,37 ℃封閉3 h后,Ⅰ抗4℃孵育過夜,用1×TBS-T溶液洗膜4×10 min。孵育Ⅱ抗,室溫45 min,1×TBS-T溶液洗膜4×10 min。用ECL試劑檢測(cè),感光膠片成像。用凝膠成像系統(tǒng)拍照,用Lab-work軟件進(jìn)行灰度分析。
結(jié)果表明,prorenin濃度為5×10-10mol/L時(shí),ERK1/2磷酸化與空白對(duì)照組比較顯著差異。5×10-9mol/L濃度時(shí)ERK1/2磷酸化程度最強(qiáng),見圖1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)prorenin濃度均選用5×10-9mol/L。
結(jié)果表明,prorenin能夠使 ERK1/2快速磷酸化,最早出現(xiàn)于作用后 5 min,10、20、35 min ERK1/2磷酸化程度逐漸增強(qiáng),35 min后不再改變。此后對(duì)p-ERK1/2觀察的時(shí)點(diǎn)選取35 min,見圖2。
結(jié)果可見,prorenin可通過激活(P)RR導(dǎo)致信號(hào)通道蛋白ERK1/2磷酸化增強(qiáng),這種作用可被信號(hào)通道阻斷劑PD98059抑制,但不能被HRP抑制,見圖3。
Figure 1.Effect of prorenin at different concentrations on p-ERK1/2 in HRMCs.The bar chart shows the relative density of p-ERK1/2 to ERK1/2..n=3*P<0.05,**P <0.01 vs control(C).圖1 不同濃度prorenin對(duì)p-ERK1/2表達(dá)的影響
Figure 2.The effect of prorenin at different time points on p-ERK in HRMCs.Time course of p-ERK1/2 after addition of human prorenin at 5×10-9mol/L was measured using Western blotting.The bar chart represents the density of p-ERK1/2 to ERK1/2..n=3.#P < 0.01 vs control(C).圖2 不同時(shí)點(diǎn)prorenin刺激對(duì)p-ERK1/2表達(dá)的影響
Figure 3.The effects of prorenin,HRP and inhibitor of ERK1/2 on p - ERK1/2 in HRMCs.HRMCs were pretreated with the AT1blocker olmsartan(Olm)and the AT2 blocker PD123319 both at 10-5mol/L,and then coincubated with other reagents.Western blotting was preformed.The bar chart shows the relative levels of p-ERK1/2 to ERK1/2 in each group..n=3.##P <0.01 vs control.C:control;N:no addition.圖3 Prorenin、ERK1/2抑制劑 PD98059和 HRP對(duì) p-ERK蛋白表達(dá)的影響
結(jié)果可見,prorenin可通過激活(P)RR導(dǎo)致TGF-β蛋白表達(dá)增高,ERK1/2信號(hào)通道阻斷劑PD98059能夠抑制TGF-β的表達(dá),但HRP不能抑制prorenin上調(diào)TGF-β的作用,見圖4。
Figure 4.The effects of prorenin,HRP and inhibitor of ERK1/2 on TGF - β production in HRMCs.HRMCs were pretreated as mentioned above.The bar chart shows the protein levels of TGF-β evaluated by ELISA in each group..n=4.##P<0.01 vs control(C).N:no addition.圖4 Prorenin、ERK1/2抑制劑PD98059和HRP對(duì)TGF-β蛋白表達(dá)的影響
結(jié)果可見,TGF-β mRNA水平與其蛋白水平相一致,即prorenin可通過激活(P)RR導(dǎo)致TGF-β mRNA水平上調(diào),這種作用可被信號(hào)通道阻斷劑PD98059抑制,但不能被HRP抑制,見圖5。
高血壓腎損傷早期多表現(xiàn)為腎小球肥大、系膜細(xì)胞增殖[5]。本研究以不同濃度的prorenin刺激體外培養(yǎng)的HRMCs,發(fā)現(xiàn)prorenin使HRMCs的ERK1/2磷酸化增強(qiáng),且ERK1/2磷酸化程度依賴于prorenin的濃度。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)ERK1/2的磷酸化可能參與腎病的發(fā)生發(fā)展[6]。
Prorenin促進(jìn)ERK1/2磷酸化理論上有二種途徑。其一,HRMCs能夠合成血管緊張素原,prorenin與(P)RR結(jié)合,發(fā)揮蛋白水解酶作用,使血管緊張素原轉(zhuǎn)化成AngⅠ,繼而生成AngⅡ,導(dǎo)致ERK1/2磷酸化增強(qiáng);其二,prorenin激活(P)RR,通過受體直接活化ERK1/2。為確認(rèn)ERK1/2磷酸化的途徑,我們阻斷了 AT1和 AT2,以 prorenin干預(yù)細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)ERK1/2磷酸化仍增強(qiáng),而以ERK1/2信號(hào)通道阻斷劑PD98059阻斷ERK1/2后,p-ERK1/2降低。由此可見,ERK1/2磷酸化是由于(P)RR過度激活的直接效應(yīng),而并非依賴于AngⅡ的生成。
Figure 5.The effects of prorenin,HRP and inhibitor of ERK1/2 on TGF - β mRNA expression in HRMCs.HRMCs were pretreated as mentioned above.RT-PCR was preformed.The bar chart shows the relative mRNA levels of TGF - β to β - actin in each group.n=1.C:control;N:no addition.圖5 Prorenin、ERK1/2抑制劑PD98059和HRP對(duì)TGF-β mRNA表達(dá)的影響
我們同時(shí)觀察到:prorenin刺激細(xì)胞后,系膜細(xì)胞分泌TGF-β增多;而ERK1/2信號(hào)通道阻斷劑可以阻斷該作用,使TGF-β蛋白和mRNA水平下降。這說明TGF-β的調(diào)控依賴于ERK1/2信號(hào)通路。研究證實(shí)TGF-β在各種進(jìn)行性腎臟纖維化疾病發(fā)展中起重要作用,是引起腎小球硬化的主要介質(zhì),抑制TGF-β的增高可預(yù)防和延緩高血壓腎病的發(fā)生、發(fā)展過程[7]。
HRP是根據(jù)prorenin前肽片段氨基酸序列合成的十肽片段。我們發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的HRMCs中,HRP并不能阻斷 prorenin激活(P)RR所誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化,也不能抑制TGF-β的蛋白表達(dá)及mRNA的上調(diào)。盡管我們提高HRP的濃度,結(jié)果仍然如此。因此我們認(rèn)為,HRP對(duì)體外培養(yǎng)的HRMCs沒有(P)RR 的阻斷作用。Ichihara 等[8-10]報(bào)道,在動(dòng)物模型中,HRP能夠阻斷(P)RR,從而延緩腎小球硬化進(jìn)展,逆轉(zhuǎn)心肌纖維化[11]。但在人平滑肌細(xì)胞和單核細(xì)胞中,HRP不能阻斷(P)RR激活所致的病理作用[12-14];在高血壓鼠模型中,HRP并不影響心肌肥厚和腎損害的進(jìn)展[15]。有學(xué)者認(rèn)為,HRP在不同的研究中對(duì)(P)RR的阻斷作用不盡相同是由于動(dòng)物模型中循環(huán)prorenin的水平不一致。由于上述觀點(diǎn)的爭議,HRP是否是(P)RR的阻斷劑尚無定論。
通過上述研究我們發(fā)現(xiàn),在體外培養(yǎng)的HRMCs中,prorenin能夠激活(P)RR,使ERK1/2活化,從而導(dǎo)致TGF-β的mRNA表達(dá)上調(diào),TGF-β蛋白表達(dá)增高,這種機(jī)制可能參與并加速腎小球硬化的發(fā)展進(jìn)程。目前臨床上應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(angiotensinⅡreceptor blocker,ARB)類藥物對(duì)于改善蛋白尿、腎小球硬化雖有可觀的療效,但長期應(yīng)用可導(dǎo)致血漿腎素活性(plasma renin activity,PRA)增強(qiáng),而腎素可不依賴于AngⅡ直接激活(P)RR導(dǎo)致靶器官功能損害加重。因此,目前為止臨床用藥中無論ACEI、ARB、腎素抑制劑aliskiren或HRP均不能阻斷(P)RR過度激活的病理作用,(P)RR仍然是藥物作用的盲區(qū)。期待將來會(huì)出現(xiàn)有效的(P)RR阻斷劑,能在RAS系統(tǒng)上游更有效地阻斷RAS系統(tǒng)的病理作用,對(duì)伴有RAS系統(tǒng)過度激活的心、腎及血管疾病帶來更多的獲益。
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