張代娟， 劉同美△， 崔曉棟， 劉江月， 郭軍堂， 王建英， 葉篤筠

(1濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山東 濰坊 261053;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，湖北 武漢 430030)

內(nèi)脂素是在2005年發(fā)現(xiàn)的一種新的脂肪細(xì)胞因子(adipocytokines)［1］。目前認(rèn)為，內(nèi)脂素是一種重要的前炎癥因子，內(nèi)脂素在血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞皆有表達(dá)，在巨噬細(xì)胞、動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊富含脂質(zhì)的區(qū)域高表達(dá)，在AS斑塊不穩(wěn)定性中發(fā)揮一定作用［2］，因此與AS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。我們前期工作觀察到活血化瘀中藥成分青心酮(3，4－dihydroxyaceto－phenone，DHAP)能通過抑制TLR4表達(dá)、TNF－α分泌起到較好的抗炎作用［3］。青心酮能否通過抑制內(nèi)脂素分泌來影響AS炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，目前尚無這方面的報道。本實(shí)驗(yàn)擬對比青心酮及辛伐他汀對ApoE(－/－)小鼠內(nèi)脂素分泌的影響，探討青心酮對AS的防治機(jī)制。

材料和方法

1 儀器

ME1000+YG－2型電鏡(USA)，Hoefer垂直型電泳槽和濕式電轉(zhuǎn)膜槽(USA)，DF－C型電泳儀(東方特力科貿(mào)中心)，Bio－Rad型轉(zhuǎn)膜儀(USA)，KD病理切片機(jī)(科迪儀器設(shè)備有限公司)，RX－2000全自動生化測定儀(Technicon)。

2 藥品與試劑

青心酮為北京制藥三廠贈送，批號為051202;辛伐他汀粉劑為浙江京新藥業(yè)公司產(chǎn)品，批號為100601－200702;RT－PCR相關(guān)試劑購自Gibco－BRL。免疫印跡法相關(guān)試劑購自北京中山生物技術(shù)有限公司。免疫組化相關(guān)試劑購自晶美公司。

3 動物

C57BL/6小鼠、ApoE(－/－)小鼠，雄性，8周齡，清潔級，體重(18.14±0.70)g，購于協(xié)和醫(yī)大實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號為scxk(京)2005－0013。

4 小鼠分組

取8只8周齡C57BL/6小鼠作為正常對照組;取24只8周齡雄性ApoE(－/－)小鼠，隨機(jī)分成3組:動脈硬化組(n=8)，建立小鼠AS模型;青心酮治療組(n=8)肌注青心酮 10 mg·kg－1·d－1;辛伐他汀治療組(n=8)肌注辛伐他汀 10 mg·kg－1·d－1。藥物劑量根據(jù)成人每天用藥臨床推薦的常用量換算［4］。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均為清潔級別，同樣溫度、濕度和光照等環(huán)境條件下適應(yīng)3 d，進(jìn)食進(jìn)水正常，體重穩(wěn)定后開始進(jìn)入實(shí)驗(yàn)程序。所有小鼠自由進(jìn)食飲水，實(shí)驗(yàn)用藥溶于生理鹽水配成混懸液，根據(jù)當(dāng)天動物體重給藥;動脈硬化組肌注生理鹽水。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼以含脂肪21%，膽固醇0.15%的“西方類型膳食”飼料至12周。

5 實(shí)驗(yàn)取材

小鼠禁食過夜(不禁水)，稱體重。經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢采血，離心分離血清，測定血清內(nèi)脂素、血脂。剪取主動脈根部靠近主動脈瓣環(huán)處約0.5 cm，用OCT組織固定液包埋固定，液氮速凍后置于－20℃冰箱保存，行冰凍切片，每個標(biāo)本在顯微鏡下觀察到完整的血管結(jié)構(gòu)后繼續(xù)切片10－16張，然后進(jìn)行油紅O染色，顯微鏡下觀察血管壁脂質(zhì)沉積、內(nèi)膜增厚及斑塊形成等病理改變。另取主動脈血管用2.5%戊二醛磷固定后環(huán)氧樹脂618包埋，切片染色，電鏡下觀察血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。

6 采用Western blotting法測定血漿、斑塊中內(nèi)脂素水平［5］

各組血樣室溫6000 r/min離心 10 min，取上清。SDS－PAGE(10%)電泳分離蛋白。將蛋白從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到NC膜上。5%脫脂奶粉封閉30 min，Ⅰ抗37 ℃2 h，TBS沖洗 3×15 min，堿性磷酸酶標(biāo)記Ⅱ抗37℃1 h，TBS沖洗4×15 min，NBT方法顯色10 min，掃描分析。血漿總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL－C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL －C)、甘油三酯(triglycerides，TG)采用全自動生化分析儀測定。

7 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS V13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗(yàn)分析。

結(jié) 果

1 青心酮對ApoE(－/－)小鼠血清內(nèi)脂素的影響

與對照組比較，動脈硬化組內(nèi)脂素增高(P＜0.01)。青心酮組、辛伐他汀組與動脈硬化組相比均明顯下降(P＜0.01)，但高于正常對照組(P＜0.01)，見表1、圖1。

表1 青心酮對ApoE(－/－)小鼠血漿內(nèi)脂素的影響Table 1.Effects of DHAP on plasma visfatin in ApoE(－/－)mice(.n=8)

表1 青心酮對ApoE(－/－)小鼠血漿內(nèi)脂素的影響Table 1.Effects of DHAP on plasma visfatin in ApoE(－/－)mice(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs AS group.

Group Dose(mg·kg－1·d－1)The ratio of plasma visfatin to β－actin Control － 10.13 ±1.06 AS － 29.22 ±1.32＊＊AS+DHAP 10 14.01 ±0.97##AS+simvastatin 10 12.74 ±1.53##

Figure 1.Effects of DHAP and simvastatin on plasma visfatin in ApoE(－ /－ )mice.A:control group;B:AS group;C:AS+DHAP group;D:AS+simvastatin group.圖1 青心酮對ApoE(－/－)小鼠血漿內(nèi)脂素的影響

2 青心酮對ApoE(－/－)小鼠血漿TC、HDL－C、LDL－C、TG的影響

青心酮對ApoE(－/－)小鼠血脂有抑制作用。與對照組相比，動脈硬化組血脂均增加(P＜0.01)。青心酮組和辛伐他汀組中TC、TG較動脈硬化組下降(P ＜0.01)，但高于空白對照組(P ＜0.01);青心酮和辛伐他汀對HDL－C、LDL－C的影響與動脈硬化組相比無明顯差異(P＞0.05)。青心酮組和辛伐他汀組之間無顯著差異(P＞0.05)，見表2。

表2 青心酮、辛伐他汀對ApoE(－/－)小鼠TC、HDL－C、LDL－C、TG的影響Table 2.The effects of DHAP and simvastatin on plasma TC，HDL－C，LDL－C，TG in ApoE(－/－)mice(.n=8)

表2 青心酮、辛伐他汀對ApoE(－/－)小鼠TC、HDL－C、LDL－C、TG的影響Table 2.The effects of DHAP and simvastatin on plasma TC，HDL－C，LDL－C，TG in ApoE(－/－)mice(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs AS group.

Group Dose(mg·kg－1·d－1)TC(mmol·L－1) TG(mmol·L－1) HDL －C(mmol·L－1)LDL －C(mmol·L－1)Control － 2.53 ±0.45 1.50 ±0.23 1.60 ±0.25 1.33±0.20 AS － 24.38 ±1.36＊＊ 2.43 ±0.21＊＊ 3.76 ±0.24＊＊ 10.12 ±0.25＊＊AS+DHAP 10 14.72 ±2.30## 1.87 ±0.33## 3.55 ±0.32 9.23 ±0.21 AS+simvastatin 10 13.47 ±1.75## 1.58 ±0.27##3.64 ±0.26 9.47 ±0.28

3 主動脈根部病理改變

油紅O染色可見，對照組僅在外膜有少量紅染脂質(zhì)，動脈硬化組血管切片中不僅可以看到紅染脂質(zhì)浸潤，而且可以看到內(nèi)膜增厚，并在多個血管切片上出現(xiàn)較大斑塊形成，該組有4處斑塊;青心酮治療組血管切片可看到明顯內(nèi)膜增厚，但斑塊數(shù)量較動脈硬化組減少，該組可見2處斑塊;辛伐他汀治療組內(nèi)膜也有增厚，但較青心酮治療組稍輕，有1處斑塊形成，見圖2。

4 青心酮對ApoE(－/－)小鼠斑塊中內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的影響

電鏡觀察對照組內(nèi)皮細(xì)胞邊緣清楚，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，平滑肌細(xì)胞無遷移現(xiàn)象。與對照組比較，動脈硬化組內(nèi)皮細(xì)胞空泡樣變，線粒體髓樣變，細(xì)胞質(zhì)電子密度低;平滑肌細(xì)胞核不規(guī)則，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，纖維髓樣變。青心酮組、辛伐他汀組有類似改變，但較動脈硬化組變化減輕，見圖3。

5 青心酮對ApoE(－/－)小鼠動脈粥樣硬化斑塊中內(nèi)脂素表達(dá)的影響

青心酮對ApoE(－/－)小鼠動脈粥樣硬化斑塊中內(nèi)脂素表達(dá)有抑制作用。與動脈硬化組相比，青心酮組、辛伐他汀組均降低(P＜0.01)，但兩者之間無顯著差異(P ＞0.05)，見表3、圖4。

Figure 2.Oil red O staining(×4).A:control group;B:AS group;C:AS+DHAP group;D:AS+simvastatin group.圖2 各組小鼠主動脈根部橫斷面油紅O染色病理切片

Figure 3.The effects of DHAP and simvastatin on vascular smooth muscle cells and endothelial cells at atherosclerosis plaque of ApoE(－ /－)mice(×7000).A:control group;B:AS group;C:AS+DHAP group;D:AS+simvastatin group.A －D:endothelial cells;E －H:vascular smooth muscle cells.圖3 青心酮對ApoE(/－)小鼠斑塊中內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的影響

表3 青心酮對ApoE(－/－)小鼠動脈粥樣硬化斑塊中內(nèi)脂素表達(dá)的影響Table 3.The effects of DHAP on visfatin at atherosclerosis plaque of ApoE(－/－)mice(.n=8)

表3 青心酮對ApoE(－/－)小鼠動脈粥樣硬化斑塊中內(nèi)脂素表達(dá)的影響Table 3.The effects of DHAP on visfatin at atherosclerosis plaque of ApoE(－/－)mice(.n=8)

＊＊ P ＜0.01 vs AS group.

Group Dose(mg·kg－1·d－1)The ratio of visfatin to β－actin Control － 3.11 ±1.54 AS － 41.20 ±1.30 AS+DHAP 10 19.94 ±0.68＊＊AS+simvastatin 10 17.46 ±1.05＊＊

Figure 4.The effects of DHAP on visfatin at atherosclerosis plaque of ApoE(－ /－ )mice.A:control group;B:AS group;C:AS+DHAP group;D:AS+simvastatin group.圖4 青心酮對ApoE(－/－)小鼠動脈粥樣硬化斑塊中內(nèi)脂素表達(dá)的影響

討 論

內(nèi)脂素是在2005年發(fā)現(xiàn)的一種新的脂肪細(xì)胞因子(adipocytokines)［1］，又稱前B細(xì)胞克隆增強(qiáng)因子(PBEF)，研究表明，內(nèi)脂素具有類胰島素作用，能夠促進(jìn)脂肪的合成與聚集，與2型糖尿病、胰島素抵抗、肥胖有關(guān)系［6，7］?，F(xiàn)已證實(shí):內(nèi)脂素可通過和一些尚未確認(rèn)的受體結(jié)合，劑量依賴性地上調(diào)單核細(xì)胞IL－1β、IL－1Ra、IL－6、IL－10和 TNF－α 水平［2，8］，可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞 MCP －1 和 IL －6 的表達(dá)［9］，因此，內(nèi)脂素是一種重要的前炎癥因子，與AS的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，但是內(nèi)脂素通過哪條途徑影響AS發(fā)生發(fā)展，目前尚未明確。有研究表明內(nèi)脂素可劑量依賴性增強(qiáng)人內(nèi)皮細(xì)胞NF－κB活性，通過NF－κB通路介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶2/9(MMP－2/9)、血管黏附分子、趨化因子等基因表達(dá)，促進(jìn)血管性炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展［10］。另外，內(nèi)脂素還能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞MCP－1和IL－6的表達(dá)［11］。

傳統(tǒng)中藥青心酮，又名3，4－二羥基苯乙酮(3，4－dihydroxyacetophenone，DHAP)，是從活血化瘀中藥毛冬青根中提取的有效成分。青心酮具有較好的抗炎作用，與其下調(diào)TLR4、抑制TNF－α分泌、促進(jìn)血紅素氧合酶 －1(heme oxygenase－1，HO－1)/一氧化碳(carbon monoxide，CO)生成，及作用于環(huán)加氧酶－2(cyclooxygenase－2，COX －2)有關(guān)［3］。他汀類藥除能有效降低膽固醇外，還可使斑塊消退，進(jìn)而減少冠心病臨床事件的發(fā)生及降低心血管病死亡率［12］。

本實(shí)驗(yàn)中普通飼料喂養(yǎng)的ApoE(－/－)小鼠即可出現(xiàn)較嚴(yán)重的高脂血癥，并容易在動脈壁形成動脈粥樣硬化斑塊，高脂飼養(yǎng)可加速動脈粥樣硬化形成，且斑塊的分布與人類動脈粥樣硬化斑塊的分布極為相似。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):青心酮亦能降低血脂水平，與辛伐他汀有相似的作用;青心酮和辛伐他汀皆能抑制ApoE(－/－)小鼠血漿內(nèi)脂素的生成量及斑塊中內(nèi)脂素的分布，可能通過此途徑減少斑塊的形成及減輕病變的程度。

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