陳 帥，劉貫山，楊愛國，王元英，孫玉合

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草類作物質(zhì)量控制重點開放實驗室，青島 266101）

煙草（Nicotiana tabacumL.）是我國重要的經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟中具有很重要的地位。煙草的田間種植經(jīng)常受到馬鈴薯Y病毒（PVY）等多種病原菌的侵染且危害程度越來越重，嚴重影響煙草種植和煙葉生產(chǎn)[1]。植物在長期進化過程中，為最大限度地減輕病害脅迫造成的傷害，形成了一系列復(fù)雜的機制，期間會引發(fā)和激活上千種基因的表達[2]。

快速應(yīng)答在植物應(yīng)對外界環(huán)境生物脅迫和非生物脅迫中起到重要作用，是植物一種積極有效的反應(yīng)。脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因（ERD）是可以快速應(yīng)答干旱反應(yīng)的基因，最早是在擬南芥脫水誘導(dǎo)1 h獲得的[3]。目前在擬南芥中已獲得16個ERD基因，它們屬于不同的基因家族，作用于不同的代謝途徑，通過不同的方式增強擬南芥的抗旱性；除了具有快速應(yīng)答干旱脅迫的特征，還具有應(yīng)答冷、鹽、衰老、ABA等多種逆境脅迫信號的特征[4]。其中ERD15是受干旱誘導(dǎo)快速應(yīng)答的基因，編碼1個親水性蛋白[5-6]，該基因受干旱、高鹽、低溫、外界損傷、ABA、水楊酸、植物病原菌等多種生物脅迫和非生物脅迫的刺激誘導(dǎo)快速表達[7]。

目前生產(chǎn)上對于煙草 PVY的防治尚無有效的藥劑，所以篩選相關(guān) PVY抗性基因，從而選育抗PVY煙草品種在該病害的綜合治理中顯得尤為重要。本研究通過抑制差減雜交和cDNA芯片從煙草抑制差減雜交文庫中篩選得到一個脫水誘導(dǎo)蛋白基因。通過實時熒光定量PCR技術(shù)，分析該基因在PVY不同誘導(dǎo)時期的表達模式，揭示其在不同誘導(dǎo)時期的表達量以及對 PVY誘導(dǎo)的應(yīng)答機制，以期為利用該基因改良普通煙草的抗 PVY能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

供試材料為高抗PVY的白肋煙VAM。將種子播種于消毒的土壤和播種盤中，置于溫室自然光照條件下培養(yǎng)，待幼苗長至 4～5片真葉時，采用摩擦法[8]進行 PVY接種（10倍接種液）處理，分別收集接種處理及未接種對照（空白接種液處理）在12 h、24 h、2 d、3 d、5 d和8 d 6個時間點的葉片組織。所有實驗材料凍存于-70℃冰箱中備用。

1.2 總RNA提取與mRNA分離純化

取接種處理及未接種對照在6個不同時間點的葉片各1 g，在液氮中速凍研磨。采用Trizol法提取葉片總RNA，提取步驟參照RNApure超純總RNA快速提取試劑盒說明書進行（蓋寧生物）。將提取的RNA溶解后置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒔臃N處理和未接種對照的6個時間點的總RNA等量混合，形成500 μg的總RNA池，用于mRNA的分離。mRNA的分離純化參照PolyA Tract mRNA Isolation Systerms試劑盒（Promaga公司）的說明書進行，分離純化mRNA的量為2 μg。

1.3 篩選PVY誘導(dǎo)表達的EST序列

抑制差減雜交方法的具體操作按照CLONTECH PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit試劑盒（Clontech公司）使用手冊進行。取適量純化的抑制差減雜交產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化、構(gòu)建抑制差減雜交文庫。從該文庫中挑取陽性PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化濃縮，點制cDNA芯片。根據(jù)6個不同的接種時間點，制備6張cDNA芯片，分別反映不同接種時間點的基因表達情況。以Cy5標記接種PVY的煙草葉片mRNA（處理），Cy3標記未接種PVY的煙草葉片mRNA（對照）作為探針分別與6張芯片雜交，每張芯片反映的是處理與對照兩個樣品的比較結(jié)果，以兩個樣品的比值Ratio值作為差異表達的參考值。Ratio值≥2或≤0.5的表示表達有差異的基因；Ratio值在0.5～2之間的屬于表達基本沒有差異的基因。對所獲得上調(diào)表達克隆進行測序，對所獲得的ESTs序列信息在NCBI的Blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）網(wǎng)站上進行比對分析，從差異表達片段中挑取脫水誘導(dǎo)基因的EST序列。

1.4 序列分析

利用NCBI的ORfinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預(yù)測該序列的開放閱讀框，通過NCBI網(wǎng)站的Blast程序進行核苷酸序列與氨基酸序列的同源性比對。采用DNAMAN（6.0版）預(yù)測編碼產(chǎn)物的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、分子量和等電點。應(yīng)用DNAStar Protean軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。用ClustalX（1.83版）對NtERD1與擬南芥的16個ERD編碼的氨基酸序列進行多重比對，并通過 MEGA4.0軟件[9]構(gòu)建鄰接法 NJ（neighbor joining）系統(tǒng)樹[10]。

1.5 實時熒光定量PCR分析

分別取不同接種時間點和空白接種對照的葉片組織總RNA 3 μg為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA的合成按照PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）的說明書操作。對實驗中不同處理的cDNA模板進行 10倍梯度稀釋，分別對內(nèi)參基因Actin和目的基因特異引物進行擴增獲得標準曲線，縱坐標為臨界循環(huán)值Ct，橫坐標為稀釋濃度的對數(shù)值。根據(jù)標準曲線所得的線性計算公式[11]得到目的基因相對濃度。

利用熒光染料法進行相對熒光定量PCR反應(yīng)，以煙草Actin基因（NTU60495）為內(nèi)參，采用25 ul PCR體系，包括12.5 ul SYBR Green Master mix reagent、10 ul無菌水、0.5 ul DyeⅡ、1 ul cDNA和各0.5 ul（2 mM）的熒光定量上、下游引物（RTF:5'- CAC TGA TAA GAA CTA TGC GTT CAC -3';RTR: 5'- CTA AGC TAA TCA CAT TCA GCG AG -3';ActinF: 5'-CAA GGA AAT CAC CGC TTT GG-3';ActinR: 5'-AAG GGA TGC GAG GAT GGA-3'）。PCR 程序為 95℃ 1 min，（95℃ 6s，62℃ 35 s）×35個循環(huán)。操作步驟參照 SYBR?Premix Ex Taq?（Perfect Real Time）（TakaRa公司）的操作說明書進行，每個樣品設(shè)3次重復(fù)。通過ABI 7500 Fast Real-Time PCR System的SDSShell.exe分析系統(tǒng)分析NtERD1的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 煙草脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因的篩選及序列分析

以6個不同PVY接種時期的煙草葉片mRNA作為探針，利用cDNA芯片篩選已構(gòu)建的抑制差減雜交文庫。cDNA芯片分析結(jié)果顯示，共有915個上調(diào)表達的克?。≧atio值＞2）（cDNA芯片結(jié)果未顯示），挑選部分上調(diào)表達的克隆進行測序。克隆序列經(jīng)在NCBI網(wǎng)站比對分析發(fā)現(xiàn)，其中一條745 bp的EST序列與番茄（Lycopersicon esculentum）脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因ERD15（GenBank登錄號AF261139）高度同源。ORfinder分析結(jié)果顯示，該序列包含一個492 bp的開放讀碼框，編碼163個氨基酸（圖1）。氨基酸Blastp比對顯示，該氨基酸序列與其他植物脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答蛋白具有很高的同源性，與番茄ERD15（AAF75749）同源性為85%，與辣椒（Capsicum annuum）ERD15（ABB89735）同源性為74%，因此，該EST序列為煙草脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因，被命名為NtERD1（Nicotiana tabacum early responsive to dehydration 1），GenBank登錄號為GU144573。

注：核苷酸和氨基酸序數(shù)在左邊用數(shù)字標出，起始密碼子和終止密碼子加框標出。

DNAMAN（6.0版）分析一級結(jié)構(gòu)表明，NtERD1編碼的氨基酸分子量為 18.4 kD，等電點（pI）為4.36。應(yīng)用DNAStar Protean軟件的Garnier法進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，NtERD1屬于一種混合型蛋白，在二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋占7.98%，β片層占54%，Turn轉(zhuǎn)角占19%，Coil無規(guī)則卷曲占19%。

2.2 NtERD1系統(tǒng)進化樹分析

目前在植物中獲得具有ERD特征的基因較少，研究報道主要集中在擬南芥上，功能研究較全面，因此本文利用MEGA4.0軟件對煙草NtERD1和16個擬南芥ERD蛋白構(gòu)建鄰接法NJ系統(tǒng)樹（圖2）。進化分析表明，NtERD1與AtERD15進化關(guān)系較近，它們可能是直系同源蛋白。

2.3 NtERD1熒光定量表達分析

應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)對NtERD1在空白接種對照及接種處理的表達特性進行分析。融解曲線分析表明，內(nèi)參基因Actin（圖3a）和目的基因NtERD1（圖3b）的擴增產(chǎn)物均呈較為銳利的單一峰，Tm分別為83℃和84.5℃左右。將反轉(zhuǎn)錄得到的煙草葉片cDNA模板按照50、5-1、5-2、5-3和5-4濃度進行稀釋，以稀釋濃度的對數(shù)值為橫坐標，以臨界循環(huán)值為縱坐標分別對內(nèi)參基因和目的基因進行標準曲線制作。以普通煙草Actin基因設(shè)計的ActinF和ActinR為熒光定量PCR反應(yīng)引物，按熒光定量反應(yīng)體系進行反應(yīng)，構(gòu)建內(nèi)參基因標準曲線，R2=0.998297，標準曲線斜率為-3.538515，截距為31.255245，直線方程為Y= -3.538515X+31.255245（圖4a）；以普通煙草目的基因設(shè)計的RTF和RTR為熒光定量 PCR反應(yīng)引物，構(gòu)建目的基因標準曲線，R2=0.992372，標準曲線斜率為-4.266456，截距為 30.819479，直線方程為Y= -4.266456X+30.819479（圖4b）。標準曲線分析表明，內(nèi)參基因和目的基因的標準曲線的線性范圍較廣，在5個數(shù)量梯度上呈良好的線性關(guān)系。

圖2 NtERD1與擬南芥16個ERD的系統(tǒng)進化關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relatedness among NtERD1 and 16 ERDs from Arabidopsis thaliana

圖3 內(nèi)參基因(a)和目的基因(b)擴增的熔解曲線Fig.3 Melting curves of the endogenous control and test gene

圖4 內(nèi)參基因(a)和目的基因(b)的標準曲線Fig.4 Standard curves of the endogenous control and test gene

在檢測的線性范圍分別收集12 h、24 h、2 d、3 d、5 d和8 d 6個時間點接種PVY和空白接種對照（CK）的煙草葉片組織并提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR表達分析結(jié)果顯示，NtERD1在PVY接種早期上調(diào)表達，接種PVY后12 h、1 d、2 d和3 d 4個時間點與空白接種對照相比表達量明顯增高，與對照相比分別增高了11%、61.6%、35.7%和76.3%，隨后表達量逐漸降低（圖5）。

圖5 NtERD1在不同時間點接種PVY的表達量Fig.5 The expression patterns of NtERD1 induced by PVY at different time stages.

3 討 論

通過進化樹的構(gòu)建，可以分析分子之間的起源關(guān)系，預(yù)測分子的功能；同一亞家族或分枝往往具有相似的功能。研究表明，同源關(guān)系較近的基因往往編碼同類蛋白，表現(xiàn)出極為相似的功能。例如擬南芥AtERD10和AtERD14，它們的編碼產(chǎn)物屬于Ⅱ型LEA蛋白家族(胚胎晚期豐富蛋白)，干旱處理1 h后在擬南芥的葉片組織強烈表達，基因的表達同時還受ABA的誘導(dǎo)，不受低溫、2，4-D、BA和GA3等其他激素的誘導(dǎo)[12]。AtERD11和AtERD13的編碼產(chǎn)物屬于硫代谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，有可能在植物脫水中避免毒素的產(chǎn)生[13]。與NtERD1同源關(guān)系較近的AtERD15受多種生物因子和非生物因子的誘導(dǎo)快速表達。過表達ERD15會降低植株對干旱、冷和ABA等脅迫的耐受力；相反，缺失ERD15的轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性和抗冷性都提高；過表達ERD15也伴隨著ABA的含量增加，植株對ABA的敏感性降低；過表達ERD15誘導(dǎo)了受水楊酸調(diào)控基因的應(yīng)答，可以抵抗病原菌[7]。因此，NtERD1也可能具有與AtERD15相似的功能。

依賴ABA途徑的脫水反應(yīng)中，植物在脫水等脅迫條件下內(nèi)源 ABA水平會顯著增加，脅迫信號首先激發(fā)ABA合成酶的作用，使ABA在細胞內(nèi)迅速積累，然后內(nèi)源ABA通過ABA受體被細胞感知，從而觸發(fā)第二信號傳遞系統(tǒng)，植物做出相應(yīng)的抵御脅迫的反應(yīng)[14]。與 NtERD1位于同一進化組中的AtERD15可能是一個新的與ABA信號脅迫相關(guān)的調(diào)節(jié)器。不依賴 ABA途徑的植物脫水誘導(dǎo)相關(guān)的蛋白，目前已鑒定出參與轉(zhuǎn)錄調(diào)解的順式作用元件和反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子），即順式作用元件DRE(dehydration responsive element)和含有AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的 DRE轉(zhuǎn)錄因子 CBF1、DREB1和DREB2[15-16]。擬南芥DEAR1編碼的蛋白包含DREB1/CBF結(jié)構(gòu)域和EAR基序。試驗研究表明，DEAR1在轉(zhuǎn)錄水平上受病原菌侵染和低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達[17]。

到目前為止，已有研究表明，植物脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因參與植物體抵御多種病原菌侵染的應(yīng)激反應(yīng)，受真菌、細菌、病毒等病原菌的誘導(dǎo)。本實驗獲得的煙草脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因NtERD1是利用cDNA芯片篩選受PVY誘導(dǎo)的抑制差減文庫得到的表達上調(diào)基因，為進一步驗證NtERD1是否受PVY侵染的誘導(dǎo)，我們利用實時熒光定量PCR研究了不同接種時期NtERD1在轉(zhuǎn)錄水平的表達量變化。結(jié)果表明，NtERD1在接種PVY 12 h、1 d、2 d和3 d時間點的煙草葉片組織中的表達量與空白接種對照的相比明顯增高，隨后逐漸降低。這表明，在PVY接種初期，NtERD1受PVY侵染早期的誘導(dǎo)上調(diào)表達，可能參與煙草早期的抗病毒反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究利用抑制差減雜交法和cDNA芯片法從受 PVY誘導(dǎo)的煙草抑制差減文庫中篩選得到一個受 PVY誘導(dǎo)上調(diào)表達的脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因NtERD1。通過系統(tǒng)進化分析，NtERD1與擬南芥AtERD15可能是直系同源基因。實時熒光定量PCR分析進一步證實，該基因是一個受 PVY侵染早期誘導(dǎo)上調(diào)表達的基因。因此可以推斷，NtERD1可能在調(diào)控?zé)煵菘共《厩秩局衅鹬匾饔谩?/p>

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