倪國仕，章新軍，畢慶文，王 瑞*

（1.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；2.湖北中煙工業(yè)有限責任公司，武漢 430051）

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）是煙草病毒病主要的毒源之一，煙草感染TMV后，常出現花葉或壞死及矮化畸形等癥狀，正常的生理功能受到不同程度的影響。光合作用是綠色植物最重要的生命活動，植物感染病毒后光合作用一般都會受到影響，已有研究表明，受病毒侵染后植物的光合速率明顯下降，葉綠體受到破壞，葉綠素含量降低，光合電子傳遞活力下降，光合磷酸化作用降低[1-4]。Wilhelmova等[5]曾研究了受TMV侵染后煙草葉中光合色素含量和葉綠素熒光參數的變化，劉國順等[6]曾報道受 TMV侵染后煙草葉中保護酶活性和超微機構的變化。本試驗研究了受TMV侵染程度不同的煙草葉片光合氣體交換參數、光合色素含量以及葉綠素熒光參數的變化，旨在進一步探討病毒影響植物光合作用的生理生化機理。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于 2009年在湖北省恩施州宣恩縣煙草示范田進行，材料為烤煙品種云煙87。黃棕壤土，土層深厚，質地偏粘，pH為5.6，有機質為24.2 g/kg，堿解氮為 135.15 mg/kg，速效磷為 21.42 mg/kg，速效鉀為195.00 mg/kg。在煙株旺長期，通過感病癥狀確定主要受TMV侵染的煙株，選取正常株、輕度感病株（有輕微花葉癥狀，感病植株只在葉片上形成黃綠相間的花葉病駁，葉片基本不變，但葉肉會出現明顯變薄或厚薄不均的癥狀）和重度感病株（花葉明顯且葉片嚴重畸形葉緣逐漸形成缺刻并向下卷曲，皺縮扭曲）。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 光合氣體交換參數的測定 在晴天上午9:30—10:30，采用美國Licor公司生產的LI-6400便攜式光合測定系統(tǒng)測定凈光合速率（Pn），氣孔導度(Gs)，胞間 CO2濃度（Ci），氣孔限制值（Ls）＝1－Ci/Co（Co為葉外空氣 CO2濃度）。人工控制條件為：CO2濃度 380 μmo1/mol，25℃，光照強度 l 000 μmol/(m2·s)。每個處理3株，選取中部葉（自下而上第 10位葉）進行光合參數的測定，每株測定 2次，取其平均值。

1.2.2 葉綠素熒光參數的測定 同步用英國Hansatech公司生產的 FMS2脈沖調制式熒光儀測定光適應條件下的穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）和穩(wěn)態(tài)最大熒光（Fm′），葉片經暗適應30 min后初始熒光（F0）和最大熒光（Fm），并計算PSⅡ活性（Fv/F0）、PSⅡ最大光能轉換效率（Fv/Fm）、光化學猝滅系數（qp）、非光化學猝滅系數（NPQ）和電子傳遞的量子產率（ΦPSⅡ），分別按下式計算[7]：Fv/F0=（Fm-F0）/F0，Fv/Fm=（Fm-F0）/Fm，qp=（Fm′-Fs）/（Fm′-F0），NPQ=（Fm-Fm′）/Fm′，ΦPSⅡ=（Fm-Fs）/Fm′。

1.2.3 光合色素的測定 同步用直徑1 cm打孔器取鮮葉，用80%丙酮研磨提取，以UV-754型分光光度計（上海亞研電子科技有限公司）測定 663、646、和470 nm處的OD值，然后計算單位面積葉綠素和類胡蘿卜素含量[8]。

2 結 果

2.1 TMV侵染對煙草葉片氣體交換參數的影響

從表1可見，與正常株相比，輕度感病株葉片凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci）分別下降了 26.05%、73.08%和 55.76%，氣孔限制值（Ls）上升了 151.85%，差異均達到顯著水平；重度感病株葉片Pn、Gs和Ls分別下降了44.61%、50.03%和18.51%，差異均達到顯著水平，Ci上升了3.76%，但差異未達到顯著水平。

表1 TMV侵染對煙草葉片凈光合速率，氣孔導度，胞間CO2濃度和氣孔限制值的影響Table 1 Effects of TMV infection on net photosynthetic rate, stomatal conductance, intercellular CO2 concentration and stomatal limitation value of tobacco leaves

2.2 TMV侵染對煙草葉片光合色素含量的影響

從表2可見，受TMV侵染的葉中葉綠素和類胡蘿卜素含量均有下降。與正常株相比，輕度感病株葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b和類胡蘿卜素分別下降了 16.28%、17.18%、16.55%和16.89%，除類胡蘿卜素外，其他均未達到顯著水平；重度感病株分別下降了 56.13%、58.69%、56.83%和57.03%，均達到顯著水平。不同感病程度煙株葉片葉綠素a/葉綠素b和葉綠素/類胡蘿卜素的比值與正常株接近，變化不大。

表2 TMV侵染對煙草葉片光合色素含量的影響Table 2 Effects of TMV infection on photosynthetic pigment content of tobacco leaves

2.3 TMV侵染對煙草葉片葉綠素熒光參數的影響

從表3可見，受TMV侵染的葉片各熒光參數均有下降。與正常煙株相比，輕度感病株葉片Fv/Fm、Fv/F0、qp、NPQ和ΦPSⅡ分別下降了1.22%、6.40%、4.60%、31.03%和4.55%，除NPQ外，其他均未達到顯著水平；重度感病株葉片分別下降了17.07%、50.90%、32.18%、75.86%和 40.91%，均達到顯著水平。

表3 TMV侵染對煙草葉片葉綠素熒光參數的影響Table 3 Effects of TMV infection on chlorophyll fluorescence parameters of tobacco leaves

3 討 論

通過對受TMV侵染的煙草葉片光合氣體交換參數、光合色素以及葉綠素熒光參數變化分析，可以看出TMV對寄主植物光合作用的影響與其他病毒相似。本研究中受TMV侵染葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量均有所下降，其主要原因可能是病毒侵染寄主植物后使其葉綠素分解酶的活性增加，或使葉綠素酯的含量降低，從而導致葉綠素含量下降而產生淺綠和暗綠相間的花葉癥狀，致使光合作用面積減少[9]；也有可能是 TMV侵染后破壞了葉綠體結構，從而導致葉綠素含量的下降[6]；類胡蘿卜素既是光合色素，又是內源抗氧化劑，除在光合作用中具有一定的功能外，在細胞內還可吸收剩余能，猝滅活性氧，從而防止膜脂過氧化[10]。由于類胡蘿卜素含量的降低，減少其對活性氧的猝滅，導致細胞內積累較多的氧自由基，破壞了葉綠體膜結構，加速了葉綠素的分解[11]。

葉綠素熒光經常被用于評價光合機構的功能和環(huán)境脅迫對其的影響[12]，本實驗測定結果表明，TMV重度侵染可以明顯降低Fv/F0、Fv/Fm和ΦPSⅡ，同時qp和NPQ也明顯表現出下降的趨勢。Fv/F0代表PSⅡ活性[13]，其值的降低表明受TMV侵染煙草葉片PSⅡ活性失活，而在TMV侵染下煙草葉片葉綠素含量下降較快和ΦPSⅡ降幅較高的結果表明，光系統(tǒng)失活的可能原因是 PSⅡ天線色素或色素蛋白復合體受到破壞[14]；Fv/Fm的下降表明，受TMV侵染煙草葉片的光合機構受到一定程度的破壞，因而，對光能的吸收和轉化效率明顯下降[15]；qp反映的是 PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學傳遞的份額，要保持高的光學猝滅就要使PSⅡ反應中心處于開放狀態(tài)，所以qp也反映了 PSⅡ反應中心開放程度，qp值的降低表明PSⅡ反應中心受體QA的還原程度更高，開放部分比例下降，關閉部分比例提高，這些關閉狀態(tài)的PSⅡ反應中心不能進行穩(wěn)定的電荷分離，因而不能參與光合電子的傳遞[9]；NPQ代表PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱能的形式耗散部分，Wilhelmova等[5]認為受TMV侵染的煙草葉片的NPQ值是上升的，而本實驗結果表明，隨著TMV侵染程度的加重，NPQ值逐漸降低，下降的可能原因是在熱耗散和清除活性氧方面起重要作用的類胡蘿卜素含量大幅下降，導致光合機構易受到破壞，耗散過剩光能的能力減弱。

引起葉片光合速率降低的植物自身因素不外乎氣孔的部分關閉和葉肉細胞光合活性下降兩類，前者使胞間CO2濃度（Ci）降低，而后者使Ci增高。當兩種因素同時存在時，變化的方向依賴于占優(yōu)勢的那個因素。也就是說，當氣孔的部分關閉是葉片光合速率降低的主要原因時，Ci降低；而當葉肉細胞光合活性降低是葉片光合速率降低的主要原因時，Ci增高[16]。根據Farquhar和Sharkey[17]提出的氣孔限制值分析觀點，判定引起葉片光合速率降低主要因素的主要根據是Ci和氣孔限制值（Ls）的變化方向，Ci降低和Ls升高表明氣孔導度降低是主要原因，而Ci增高和Ls降低則表明引起光合速率降低的主要原因是非氣孔因素。從本研究結果來看，受 TMV侵染的煙草葉片的凈光合速率（Pn）明顯下降，且隨著感病程度的增加，Pn下降的程度增大，但不同感病程度引起Pn下降的主要原因不同。在輕度感病條件下，伴隨著氣孔導度（Gs）的下降，Ci降低和Ls升高，表明引起Pn下降的主要原因是氣孔限制。在重度感病條件下，伴隨著氣孔導度（Gs）的下降，Ci增高和Ls降低，表明引起Pn下降的主要原因是非氣孔限制及葉肉細胞光合活性的下降。

由此可以推測，TMV輕度侵染主要是引起煙草葉片氣孔關閉或堵塞，阻礙了氣體的交換，從而影響到葉片的光合作用，隨著侵染程度的加重，光合色素含量大幅減少，光合機構損傷嚴重，葉片光合作用進一步受到影響。

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