嚴孚瑩

（中山大學附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)，廣東廣州 510700）

硝酸酯類藥物是治療冠心病、高血壓及心力衰竭的主要藥物，因此成為心血管病研究者關注的熱點問題。然而大部分研究集中于硝酸酯類藥物耐受的機制，而對于耐受是否還具有其他生理效應，對其治療的疾病缺乏足夠認識[1]。20世紀90年代后期，幾個大規(guī)模的臨床試驗均表明，硝酸酯類藥物對再灌注心肌細胞缺乏有明確的保護作用[2]。目前，多認為ONOO-在硝酸酯類藥物耐受加重心肌缺血-再灌注損傷中起主要作用，特別是引起再灌注后心肌細胞凋亡的增加[3-4]。本研究應用離體大鼠心臟低流量缺血-再灌注模型于缺血期給予硝酸甘油（nitroglycerin，NTG，一種 NO供體），觀察其對心肌缺血-再灌注損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗器材

1.1.1 儀器與材料 心電圖機、手術器械一套、大鼠手術臺、改進的Langendorff心臟灌流裝置。

1.1.2 藥品 托馬斯心肌保存液、NTG、碳酸氫鹽緩沖液（KHB液）、乙醚、肝素、生理鹽水等。

1.1.3 動物 雄性Wistar大鼠（2006年11月～2009年2月）36只，平均體重（313.0±26.8） g。

1.2 方法與步驟

取大鼠，稱取體重，乙醚吸入麻醉，在Langendorff心臟灌流裝置（改進型）上仰臥位固定，股靜脈注射肝素3 mg/kg，迅速進行開胸分離心臟，采用Krebs-Henseleit碳酸氫鹽緩沖液（KHBB）對心臟進行灌流，灌注壓為90 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa），該操作在1.5 min內完成，超時標本棄用；并以5 Hz（方波：40 mV）電刺激起搏心臟，并保證心臟穩(wěn)定跳動30 min，檢測項目：心率；冠狀動脈流量（CF）；左室壓力微分（dp/dt），左心室收縮壓；左心室舒張末壓，即獲得壓（LVDP）=左室收縮壓力－左室舒張末壓力，5 min/次。在本研究中將心率與獲得壓的乘積作為反映心臟機械做功的指標。心臟穩(wěn)定跳動30 min后，0.125 ml/min灌注泵對心臟進行KHBB灌流液灌流，30 min后關閉，同時再開啟Langendorff槽灌流液對心臟再灌注60 min。在用藥組，低流量泵中的KHBB灌流液以 4.4×10-3mmol/L NTG 溶液取代[4]。

實驗分組：隨機將36只大鼠心臟分為兩組，即低流量缺血期應用硝酸甘油組（用藥組，18只）及不用硝酸甘油組（對照組，18只）。用藥組根據是否于再灌注期發(fā)生心室顫動又分成心室顫動組及非心室顫動組。因此最終有三組用于結果分析。

1.3 觀察指標

采用Gerhardt法對心肌肌酸激酶進行測定[5]。分別收集缺血期心臟灌出液及再灌注期初15 min心臟灌出液進行心肌肌酸激酶測定。NO測定：采用化學發(fā)光法測定NO降解產物亞硝酸鹽含量。從缺血期總灌出液及灌注期每隔5 min的灌出液中取40 μl進行NO測定。

1.4 統計學處理

應用SPSS 14.0軟件包進行統計學分析，計量數據以均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

用藥組大鼠心臟中，10只于再灌注期恢復竇性心律（非心室顫動組），8只表現為持續(xù)心室顫動（心室顫動組）。18只對照組大鼠心臟于再灌注期全部恢復竇性心律。以上三組心臟之間缺血前心功能參數及NO釋放量無顯著差異。

2.1 對照組及非心室顫動組大鼠再灌注期心功能恢復情況 見表1。

表1 對照組及非心室顫動組心臟缺血后心功能的恢復情況（）Tab.1 The recovery of cardiac function of control group and non-ventricular fibrillation group after cardiac ischemia()

表1 對照組及非心室顫動組心臟缺血后心功能的恢復情況（）Tab.1 The recovery of cardiac function of control group and non-ventricular fibrillation group after cardiac ischemia()

與對照組比較，*P＜0.05Compared with control group,*P＜0.05

組別 例數 再灌注時間 左心室收縮壓 左心室舒張末壓 獲得壓 心率 心率×獲得壓 冠狀動脈流量（min） （mm Hg） （mm Hg） （mm Hg） （次/min）[ml/（100 g·min）]對照組182084.9±1.57.83±0.6660.7±3.286.7±2.852.1±2.476.3±3.44082.5±0.67.27±0.4560.1±1.890.8±2.754.4±1.264.5±2.3非心室顫動組102070.1±4.9*11.22±1.11*40.7±7.8*79.8±4.933.6±7.3*75.2±2.14081.3±2.58.21±0.4460.7±3.588.9±2.953.9±3.369.5±2.2

2.2 心肌肌酸激酶漏出量的比較

再灌注期心室顫動組大鼠心肌肌酸激酶漏出量明顯低于對照組及非心室顫動組（P＜0.05）。缺血期心室顫動組大鼠心肌肌酸激酶漏出量亦明顯低于非心室顫動組（P＜0.05）。見圖 1、2。

圖1 三組心臟缺血期肌酸激酶釋放量Fig.1 Creatine kinase release of heart in ischemic period in three groups

2.3 用藥組與對照組灌注前后離體心臟保存后心肌細胞電鏡下表現

圖2 三組心臟再灌注期肌酸激酶釋放量Fig.2 Creatine kinase release of heart in reperfusion period in three groups

對照組心肌細胞表現為嚴重的線粒體空泡變性及心肌纖維斷裂，用藥組心肌細胞幾乎未見線粒體空泡變性和心肌纖維的斷裂。見圖3。

2.4 硝酸酯的作用機制及一氧化氮釋放情況

以缺血期與缺血前NO釋放量的比值為指標，非心室顫動組大鼠心臟缺血期與缺血前NO釋放量比值明顯大于對照組[（17.0±4.7）對（7.2±2.1），P＜0.05]。非心室顫動組大鼠心臟缺血期與缺血前NO釋放量比值亦大于心室顫動組[（17.0±4.7）對（9.0±1.7），P＞0.05]。 心室顫動組心臟缺血期與缺血前NO釋放量比值較對照組無明顯增加[（9.0±1.7）對（7.2±2.0），P＞0.05]。 再灌注期任何時點，3 種情況間 NO 釋放量均無顯著差異。

3 討論

冠心病患者心肌細胞處于長期的缺氧狀態(tài)，應用硝酸酯類藥物后，產生缺血-再灌注損傷，大劑量使用硝酸酯類藥物，出現耐受現象，更加重了心肌缺血-再灌注損傷，特別是增加再灌注后心肌細胞凋亡。大量研究報道，過氧亞硝酸陰離子ONOO-在心肌缺血-再灌注中可能加重心肌的壞死和凋亡[6]。過氧亞硝酸陰離子ONOO-是一氧化氮衍生物，由NO和超氧陰離子（Of）反應生成，是一種重要的氮氧活性氧化合物[7]。心肌細胞凋亡的主要途徑是線粒體途徑。在心肌缺血期間，呼吸鏈上的還原型煙酰胺二核苷酸（NADH）脫氫酶受損，導致電子泄漏和活性氧介質（Ros）生成，在活體內通過線粒體呼吸鏈和NADPH氧化酶產生氧自由基（OFR）。再灌注期間，由于OFR增多和線粒體功能低下，造成ROS“瀑布式”生成[8]。硝酸酯類藥物在體內衍生出大量NO。在生物體內，若NO、OFR同時存在，會很快聚集形成ONOO-，生成的ONOO-在堿性環(huán)境下是相對穩(wěn)定的。反應程度通過NO和OFR的生成和分解相對速度可測定[9-10]。過氧亞硝酸陰離子的測定由于生物系統中ONOO-本身復雜的特性，難以隔離和測定，并且ONOO-參與多種反應，很難找出較其他反應更具競爭能力的檢測物質。此外，ONOO-和自由基Of及NO的生物效應也不易區(qū)分[11]。所以，檢測ONOO-一直是一個難題。對于過氧亞硝酸陰離子介導的心肌損傷的實驗方案，國內曾有學者設計雄性大鼠尾靜脈給予硝酸甘油，測定平均動脈壓和離體血管張力以確定是否產生硝酸甘油耐受[12]。

本研究顯示，同一劑量的NTG于缺血期灌注大鼠離體心臟，對心肌缺血-再灌注損傷產生兩種不同的（相反的）影響，即：對一部分心臟（非心室顫動組大鼠），NTG增加心肌肌酸激酶的漏出量，抑制再灌注期心功能的恢復，說明心肌損傷加重；而對另一部分心臟（心室顫動組大鼠），NTG降低心肌肌酸激酶的釋放，表明心肌損傷減輕。在非心室顫動組大鼠心臟，心肌損傷的加重伴隨著缺血期心肌組織NO釋放量的增加，推測在這種情況下NO是相對過量的，并可能通過以下途徑損傷及（或）抑制心?。孩貼O與超氧陰離子反應生成過氧亞硝酸鹽而損害心??；②NO與某些涉及細胞基礎代謝活動有關的酶（如線粒體呼吸酶）活性中心結合使酶失活；③過量的NO具有直接負性肌力作用[1,7-8]。在心室顫動組大鼠心臟，心肌損傷的減輕并不伴隨缺血期NO釋放量的明顯增加。筆者認為該水平的NO釋放有利于保護心肌。耐受大鼠的離體動脈隨機接受模擬缺血-再灌注、模擬缺血-再灌注+還原型谷胱甘肽和對照處理，未產生耐受的大鼠隨機接受模擬缺血-再灌注或對照處理，為了確定硝酸甘油耐受對缺血-再灌注血管損傷和內皮功能的影響，檢測各組灌注液中NO含量、CK和LDH活性，并觀測血管收縮能力和對乙酰膽堿的反應。免疫組化標記血管中的硝基化酪氨酸，灰度掃描分析標記強度。結果顯示，接受模擬缺血-再灌注處理的硝酸甘油大鼠血管內皮功能顯著下降，血管內硝基化酪氨酸含量顯著升高。谷胱甘肽顯著抑制硝酸甘油耐受的血管損傷。

總之，過氧亞硝酸陰離子具有很強的氧化和硝基化作用，通過對細胞內眾多的蛋白、脂質進行修飾，影響其功能，進而對心肌細胞造成損傷。在動物實驗中模擬缺血-再灌注模型，利用ONOO-的特殊檢測辦法，推測ONOO-可能介導了硝酸酯類藥物耐受加重心肌缺血-再灌注的損傷。文中產生雙重效應的原因可能與不同的大鼠心臟間將NTG轉化為NO的量不同有關。同一劑量NTG產生不同水平NO釋放量的機制尚不清楚，推測可能與個體心臟間有關將NTG轉化為NO的轉化酶對NTG的敏感性不同有關[10]。

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