劉衛(wèi)梅

（河南省焦作市第二人民醫(yī)院病理科，河南焦作 454100）

移行細胞癌是膀胱最常見的惡性腫瘤，約占90%，好發(fā)于50歲以上的男性，與外源性化學性致癌物質（苯胺、聯(lián)苯胺、萘胺等）、內源性色氨酸等代謝產物及吸煙等致癌因素有關，血尿是常見癥狀，可發(fā)生于膀胱的任何部位。血管形成是腫瘤生長、侵襲和轉移的必需因素，最近研究結果提示，某些腫瘤除誘導新生血管形成外，還能誘導新生淋巴管形成，并促進腫瘤細胞通過新生淋巴管向區(qū)域淋巴結轉移。因此，淋巴管生成系統(tǒng)不僅是許多腫瘤轉移的重要途徑，更是判斷腫瘤預后的重要指標[1]。D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的一種較特異的淋巴管內皮細胞標志物，被廣泛應用于淋巴管形成的研究[2]。本文運用免疫組織化學方法檢測膀胱移行細胞癌D2-40標記的淋巴管密度（LVD）和血管內皮生長因子（VEGF）的表達情況，探討LVD和VEGF表達的相關性及膀胱移行細胞癌臨床病理因素的關系和在膀胱移行細胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

收集我院2006年1月～2009年10月手術切除標本，經病理確診的膀胱移行細胞癌74例，患者年齡29～62歲，平均46歲。發(fā)生于肌層浸潤或淋巴結轉移的54例，黏膜內癌（惡性上皮局限于黏膜與肌層交界處）20例；其中，高分化24例，中分化23例，低分化27例。浸潤深度：＜1/2肌層25例，≥1/2肌層29例。

1.2 方法

手術標本均經4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察。應用免疫酶標組織化學二步法分別進行免疫組織化學標記，DAB顯色，乙醇梯度脫水，封固。所用一抗為兔抗人VEGF單克隆抗體，鼠抗人D2-40單克隆抗體、二抗通用型PV-9000均為即用型，由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.3 結果判定

VEGF陽性定位于細胞質和細胞膜。按照喬宏等[3]的標準進行判斷：①選染色均勻的陽性表達區(qū)域，以著色細胞占視野細胞總數(shù)的多少分級：無陽性細胞為0級；陽性細胞數(shù)≤25%為1級；26%～50%為2級；＞50%為3級。②按著色細胞染色強弱計分：無著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2 分；深棕色為 3 分。 ①+②的判斷結果：0～2 為（-）；3～6 為（+）。D2-40陽性物質定位于淋巴管內皮細胞胞質和胞膜，淋巴管計數(shù)按照Straume等[4]和潘敏鴻等[2]的方法，先后在低倍鏡（×100）下掃描切片，選擇其中淋巴管高密度區(qū)，然后在高倍鏡（×400）下計數(shù)被D2-40抗體染成棕黃色的淋巴管數(shù)目，每個內皮細胞或內皮細胞簇，只要能與鄰近脈管、腫瘤細胞或其他結締組織分開，即視為1個淋巴管。結果以10個高倍視野下的淋巴管數(shù)目均值表示測定LVD值。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 LVD和VEGF在不同膀胱組織中的表達

VEGF陽性率和LVD在正常移行上皮、不典型增生移行上皮、移行細胞癌三組中表達逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；浸潤深度≥1/2肌層組VEGF陽性率和LVD高于浸潤深度＜1/2肌層組和黏膜內癌組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；8例淋巴結轉移組VEGF陽性率和LVD高于66例無淋巴結轉移組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

LVD和VEGF陽性率在黏膜內癌組與浸潤深度＜1/2肌層組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；LVD和VEGF在膀胱移行細胞不同分化程度間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 VEGF和LVD的相關性

LVD在74例膀胱移行細胞癌VEGF陽性組中高于VEGF陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

膀胱移行細胞癌的侵襲與轉移往往伴有適宜其生物學行為表達的多種因素的變化，其中腫瘤周圍微環(huán)境的重建、血管及淋巴管的再生已成為研究的熱點。目前，國內外已有不少有關VEGF和LVD在膀胱移行細胞癌中的報道。

表1 VEGF和LVD在不同移行上皮組織中的表達（）Tab.1 The expression of VEGF and LVD in different transitional cell cancers()

表1 VEGF和LVD在不同移行上皮組織中的表達（）Tab.1 The expression of VEGF and LVD in different transitional cell cancers()

病理改變 n VEGF[n(%)]LVD P值-+組織類型正常移行上皮1413（92.86）1（7.14）2.90±0.96＜0.05移行上皮非典型增生159（60.00）6（40.00）5.29±1.31移行細胞癌7424（32.43）50（67.57）10.03±3.38癌分化程度高2410（41.67）14（58.33）10.15±3.45＞0.05中238（34.78）15（65.22）9.40±4.15低276（22.22）21（77.78）10.47±2.52肌層浸潤無（黏膜內癌）2010（50.00）10（50.00）8.33±2.01＜0.05＜1/2肌層2510（40.00）15（60.00）9.03±2.95≥1/2肌層294（13.79）25（86.21）11.18±2.81淋巴結轉移無6624（36.36）42（63.64）9.50±2.87＜0.05有80（0）8（100.00）15.42±3.12

表2 膀胱移行細胞癌中VEGF和LVD的關系（）Tab.2 The relationship between VEGF and LVD in bladder transitional cell cancers()

表2 膀胱移行細胞癌中VEGF和LVD的關系（）Tab.2 The relationship between VEGF and LVD in bladder transitional cell cancers()

VEGF n LVDP值-246.99±1.78＜0.05+5011.62±3.00

VEGF是由2條亞基間及其亞基內二硫鍵連接而成的同源性二聚體糖蛋白化合物，是一種具有高度特異性的內皮細胞有絲分裂原，可以選擇性地增強血管和淋巴管內皮細胞的有絲分裂，刺激內皮細胞增殖并促進脈管生成，提高脈管特別是小脈管的通透性，增強其趨化性，促進新生脈管的建立[5]。VEGF家族成員包括VEGF-A、-B、-C、-D和胎盤生長因子（PIGF）。VEGF-A始終被認為只能通過VEGFR-1、VEGFR-2途徑作用于血管內皮細胞，促進血管形成過程。然而最近的體外研究結果顯示，VEGF-A也可以促進淋巴管內皮細胞增殖、遷移，而且體外和體內原位試驗研究也發(fā)現(xiàn)淋巴管內皮細胞表面存在VEGFR-2的表達，VEGF-A促進淋巴管內皮細胞增殖和遷移的作用可以通過阻斷VEGFR-2被抑制[6-7]。Hirakawa等[8]在轉基因小鼠中發(fā)現(xiàn)VEGF-A不僅強烈促進腫瘤血管生成，也促進了表達VEGFR-2的腫瘤淋巴管活化與增殖及腫瘤向前哨淋巴結、遠端淋巴結的轉移。此外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的VEGF-C是VEGF家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的淋巴內皮細胞生長因子，目前已在大多數(shù)人類惡性腫瘤（如前列腺癌、結直腸癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、惡性黑色素瘤、纖維肉瘤等）組織中檢測到，其表達均明顯高于正常組織，并與腫瘤淋巴管形成、淋巴結轉移及預后密切相關。Stacker等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-D不但可誘導腫瘤組織內的淋巴管形成，而且可導致腫瘤細胞向區(qū)域淋巴結擴散。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常移行上皮、不典型移行上皮、移行細胞癌組織中VEGF陽性率逐漸增高，并與浸潤深度和淋巴結轉移有關，提示VEGF在移行細胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，并可作為移行細胞癌惡性程度及預后判斷的指標。同時研究發(fā)現(xiàn)，VEGF陽性率與腫瘤細胞的分化程度無明顯相關性。移行細胞癌中VEGF陽性組的LVD明顯高于VEGF陰性組，也提示VEGF具有促進淋巴管生成的作用。

腫瘤的生長與腫瘤血管的形成密切相關，但在腫瘤生長的早期，尤其是轉移瘤生長早期，其營養(yǎng)物質的提供主要靠彌散方式及微淋巴管、新生淋巴管通過擴張形式提供，且隨著腫瘤生長淋巴管數(shù)量也在增加；管壁結構發(fā)生改變，在有腫瘤細胞靠攏的地方會出現(xiàn)明顯的間隙或缺口，有利于腫瘤細胞進入淋巴管腔[10]。由于高LVD使腫瘤細胞進入淋巴系統(tǒng)更加容易，因此多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)淋巴管的形成促進了癌的淋巴結轉移[11-12]，但也有不一致之處。Straume等[13]對皮膚惡性黑色素瘤的研究顯示，癌內及癌周LVD與其淋巴轉移呈負相關；而Birner等[14]在卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，LVD與淋巴結轉移無關。然而多數(shù)研究認為，腫瘤淋巴管生成能促進癌的淋巴結轉移[11-12,15-16]，造成分歧的可能原因是：①不同腫瘤淋巴管生成的機制可能存在一定的差異；②研究樣本量較?。虎凼褂玫奈⒘馨凸軜酥疚锊煌?。近年來，一些淋巴管內皮細胞標志物，如VEGFR-3、淋巴內皮透明質酸受體-1（lymphatic vessel endothelial HA receptor-1，LYVE-1）和 podoplanin 等相繼出現(xiàn)，使得腫瘤淋巴管形成的研究取得了較大的進展，但隨后的研究證實，這些標志物并不是淋巴管內皮細胞特異性標志物。D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的一種比較特異的淋巴管內皮細胞標志物，使淋巴管計數(shù)及測量成為可能。本研究應用鼠抗人D2-40單克隆抗體檢測不同不典型移行上皮組織中的LVD發(fā)現(xiàn)，在正常移行上皮、不典型移行上皮、不典型移行上皮復雜性增生伴不典型增生、移行細胞癌組織中LVD逐漸增高，并且隨著肌層浸潤深度和淋巴結轉移而升高，提示淋巴管生成在移行細胞癌發(fā)展過程中起重要作用，與侵襲轉移相關。本研究發(fā)現(xiàn)，移行細胞癌的分化程度與LVD無關，LVD與淋巴結轉移相關。移行細胞癌的分化程度與淋巴結轉移是否相關有待于進一步研究。一般認為腫瘤的分化程度與淋巴結轉移有關，造成分歧的可能原因是：①移行細胞癌淋巴結轉移的相關因素很多，除腫瘤細胞的分化程度之外，可能其他相關基因及因子在其中發(fā)揮了更重要的作用，是多種因素共同作用的結果；②研究的樣本量少。

淋巴管的生成受多基因調控、多因素影響，在諸多因素中，VEGF家族已被證實與淋巴管的生成有關，此外還有透明質酸（HA）、細胞外基質（ECM）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、整合素 α9β1、NRP-2、Net、Prox-1 和 Ang-2 等，但它們之間的相互關系及作用機制尚不清楚。不同個體及不同組織來源的惡性腫瘤，其惡性生物學行為表達的方式和程度各不相同。本研究初步探討了子宮內膜樣腺癌LVD與VEGF表達的相關性、兩者與子宮內膜樣腺癌臨床病理因素的關系及在其發(fā)生、發(fā)展中的作用。對于相關因素的探討可對子宮內膜樣腺癌惡性生物學行為的表達提供進一步的認識，為臨床治療及預后提供參考指標。郭子妲等[1]在裸鼠中發(fā)現(xiàn)應用針對VEGF的人源VEGF單克隆抗體Bevacizumab（Avastin）能夠抑制腫瘤血管和淋巴管的生成，從而切斷腫瘤的營養(yǎng)供應，更為有效地抑制腫瘤生長。隨著腫瘤淋巴管生成機制研究的不斷深入，針對特定腫瘤的抗腫瘤新生淋巴管治療有望成為繼抗腫瘤新生血管治療之后的又一種腫瘤生物治療新模式，具有良好的研究和應用前景。

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