李金鞠 任 華 王自強 錢杜 冰 (華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200062)

維甲酸誘導(dǎo)基因I(Retinoic acid-inducible gene-I,Rig-I)是2000年由Liu等[1]在全反式維甲酸(All-Trans Retinoic Acid,ATRA)誘導(dǎo)APL細(xì)胞株向NB4細(xì)胞分化過程中發(fā)現(xiàn)的一個上調(diào)表達(dá)的基因,越來越多的研究表明,Rig-I在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。Rig-I由兩個半胱天冬酶募集域(Caspase Recruitment Domain,CARDs)和一個DExD/H-box RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域(Helicase)組成,全長925個氨基酸。其中DExD/H-box RNA Helicase結(jié)構(gòu)域高度保守,并且?guī)缀醮嬖谟谒械纳矬w內(nèi)(從病毒、細(xì)菌、酵母到小鼠等哺乳動物),這種酶具有內(nèi)在的ATP酶活性,參與了包括轉(zhuǎn)錄、RNA干擾(RNAi)、模式識別等在內(nèi)的許多重要的生物學(xué)過程[2,3]。Rig-I的Helicase結(jié)構(gòu)域能通過降解ATP識別并結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中的病毒雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA),進(jìn)而引起N端 CARDs構(gòu)象的改變,使它能夠與其他具有CARDs結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白 IPS-1(也稱作VISA/Cardif/MAV-1)結(jié)合,最終激活I(lǐng)RF-3、IRF-7和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的活性,誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素合成,參與機體天然免疫中的抗病毒作用[4-12]。然而,到目前為止,對于Rig-I中Helicase結(jié)構(gòu)域可結(jié)合病毒dsRNA的種類以及結(jié)合方式的研究仍存在很多爭議,因此,針對Rig-I尤其是Helicase結(jié)構(gòu)域的高效抗體制備工作將對Rig-I蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及天然免疫識別機制的研究有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 質(zhì)粒DNA小量快速制備試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、真核細(xì)胞蛋白裂解液購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司。限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XholⅠ、T4連接酶購自日本TaKaRa公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。異丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)購自德國Merck公司。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Sigma公司。含全長Rig-I基因的質(zhì)粒pET15b、質(zhì)粒pET15b(+)、感受態(tài)細(xì)胞菌株:E.coli DH5α、BL21由本實驗室保存(購自博大泰克公司)。小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞株Raw264.7購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 mRig-I-H基因擴增 根據(jù)NCBI獲取小鼠Rig-I基因(Gene ID:230073)的核苷酸序列,對其C末端Helicase結(jié)構(gòu)域(mRig-I-H,726～2 240 bp)進(jìn)行克隆。為了便于克隆和表達(dá),在PCR特異性上下游引物兩端分別加入NdeⅠ和XholⅠ酶切位點以及相應(yīng)的保護(hù)堿基,以含全長Rig-I基因的質(zhì)粒為模板擴增小鼠Rig-I基因C端1 500 bp左右的片段。上游引物:5′GGAATTATCATCCTGACACCCCAGATTCTTGTG 3′;下游 引物 :5′CCGTCAGCTGCTGGTCAGGAGGAAGCACTT 3′;PCR擴增條件為:94℃預(yù)變性 2分鐘;94℃變性 30秒,60℃退火 30秒,72℃延伸 90秒(30個循環(huán));72℃再延伸,5分鐘。擴增的產(chǎn)物上1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2 原核表達(dá)載體pET15b-mRig-I-H構(gòu)建 用NdeⅠ和XholⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物與pET15b(+)質(zhì)粒,37℃酶切3小時。1%瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收。T4連接酶將酶切載體和PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接,16℃反應(yīng)過夜。次日,轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α,挑取轉(zhuǎn)化后單克隆菌落擴增培養(yǎng),菌液PCR初步鑒定。質(zhì)粒抽提純化后,限制性內(nèi)切酶(NdeⅠ和XholⅠ)雙酶切鑒定。PCR、酶切鑒定后的重組質(zhì)粒由上海鼎安生物科技有限公司基因測序,陽性質(zhì)粒命名為pET15b(+)-mRig-I-H。

1.2.3 mRig-I-H蛋白表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET15bmRig-I-H轉(zhuǎn)化入E.coli BL21,挑取單菌落于含氨芐青霉素的LB中,37℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。次日按1∶100轉(zhuǎn)接入1 L含氨芐青霉素的LB后,37℃220 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6。吸取部分樣品作為陰性對照。加入終濃度為0.25 mmol/L的IPTG,20℃220 r/min誘導(dǎo)18小時。4℃4 000 r/min離心收集菌體。冰浴超聲破菌,4℃12 000 r/min離心30分鐘,收集上清和沉淀,10%SDS-PAGE分析mRig-I-H表達(dá)水平。

1.2.4 mRig-I-H蛋白分離純化、濃度測定及Western blot分析 蛋白純化采用割膠回收的方法:于超生破菌后的包涵體中加入2×上樣緩沖液重懸后置100℃沸水中煮 10分鐘。電泳結(jié)束后用預(yù)冷的250 mmol/LKCl浸泡膠至顯示出乳白色的蛋白條帶,在相應(yīng)位置切下目的條帶。PBS洗滌至條帶透明,研磨,溶于體積為膠條體積一半的PBS中。4℃,浸泡過夜。次日,4℃,12 000 r/min,離心20分鐘,取上清,凍存于-20℃以備用。采用Bradford法測定融合蛋白的濃度。純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,目的蛋白帶有His標(biāo)簽,以抗His單抗作為一抗(1∶1 000),HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗(1∶5 000),ECL顯色,暗室曝光顯影。

1.2.5 多克隆抗體制備及效價、Western blot檢測將純化的mRig-I-H蛋白與弗氏完全佐劑等量(等體積)乳化后,經(jīng)背部皮下多點注射1只成年雄兔,每點約200μg。以后將純化的mRig-I-H蛋白與弗氏不完全佐劑隔2周加強1次;從第3次加強免疫后7天,頸動脈取血,分離血清后,與等量甘油混合,無菌分裝保存于-80℃?zhèn)溆?。間接ELISA檢測免疫血清效價。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,以免疫血清作為一抗(1∶3 000),HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗(1∶5 000),ECL顯色,暗室曝光顯影。

1.2.6 Western blot及細(xì)胞免疫熒光檢測RAW264.7中Rig-I蛋白 每孔按 105個細(xì)胞的數(shù)目將RAW264.7鋪于 6孔板內(nèi),于 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。用終濃度10μg/ml的LPS刺激細(xì)胞24小時,對照孔加入相同體積的PBS,37℃孵育24小時[13-15]。裂解細(xì)胞獲得的細(xì)胞全蛋白經(jīng)SDS-PAGE后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,以免疫血清作為一抗(1∶6 000),HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗(1∶10 000),ECL顯色。每孔按104個細(xì)胞的數(shù)目將RAW264.7鋪于24孔板內(nèi),于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。用終濃度 10μg/ml的 LPS刺激細(xì)胞,對照孔加入相同體積的PBS,37℃孵育24小時。PBST洗去培養(yǎng)基后,用4%多聚甲醛和3‰Triton X-100于冰上固定細(xì)胞30分鐘,PBST洗滌3次。PBST-5%脫脂奶粉封阻1小時,PBST洗3次。加入免疫血清(1∶50),4℃孵育過夜,PBST洗5次。加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶300),室溫孵育,PBST洗5次。PI室溫作用,PBST洗滌后,緩沖甘油封片,熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,400倍放大,拍照記錄結(jié)果。

1.2.7 激光共聚焦顯微鏡檢測Rig-I蛋白的亞細(xì)胞定位 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞接種于內(nèi)置爬片的24孔板中,用終濃度10μg/ml的LPS刺激細(xì)胞,對照孔加入相同體積的PBS,37℃孵育24小時。PBST洗去培養(yǎng)基后,經(jīng)4%多聚甲醛和3‰Triton X-100于冰上固定30分鐘,PBST洗滌3次。PBST-5%脫脂奶粉封阻1小時,PBST洗3次。加入免疫血清(1∶50),4℃孵育過夜,PBST洗5次。加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶300),室溫孵育,PBST洗5次。PI室溫作用,PBST洗滌后,抗熒光猝滅劑封片,Confocal顯微鏡下觀察,拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增mRig-I-H片段 應(yīng)用PCR方法擴增Rig-I基因C末端Helicase結(jié)構(gòu)域(726～2 240 bp),瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR擴增得到1 500 bp大小的DNA片段,與理論基因片段大小相似。

2.2 pET15b(+)-mRig-I-H雙酶切鑒定 經(jīng)過篩選的陽性克隆擴增后提取質(zhì)粒,雙酶切鑒定結(jié)果顯示質(zhì)粒中包含的目的基因片段大小與預(yù)期值相符(圖1)。測序結(jié)果經(jīng)gene runner軟件分析,序列完整正確且讀碼框無誤,表明構(gòu)建成功。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物及重組質(zhì)粒p ET15b(+)-mRig-I-H瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR product and digesting recombinant p ET15b(+)-mRig-I-H plasmid

2.3 mRig-I-H蛋白的表達(dá)量和表達(dá)形式鑒定 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE分析顯示,在大小約為40 kD處出現(xiàn)目的蛋白條帶,與理論計算值相符,主要以包涵體形式表達(dá),以0.4、1、10mg/ml三種不同濃度的BSA為參照,粗略估計目的蛋白的表達(dá)量(圖2)。

圖2 SDS-PAGE分析mRig-I-H在大腸桿菌BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2 SDS-PAGE analysis for expression of mRig-I-H in E.coli BL21

圖3 純化mRig-I-H蛋白的SDS-PAGE檢測Fig.3 SDS-PAGE analysis for the purified mRig-I-H protein

2.4 mRig-I-H蛋白的純化和Western blot檢測與濃度測定 蛋白經(jīng)割膠純化后,SDS-PAGE(圖3)和Western blot(圖4A)結(jié)果顯示,相對分子量約40 kD處有特異性條帶出現(xiàn),表明純化后所得蛋白確為所表達(dá)的目的蛋白。根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得純化蛋白濃度為2.83mg/ml。將純化的mRig-I-H蛋白包被于酶標(biāo)板,間接ELISA法測定兔抗血清效價在1∶100 000左右。以制備的抗mRig-I-H兔免疫血清作為一抗進(jìn)行Western blot鑒定,結(jié)果顯示:誘導(dǎo)表達(dá)菌蛋白及純化蛋白在大小約40 kD處出現(xiàn)了特異蛋白條帶,而在未加誘導(dǎo)劑的菌體蛋白中未見有反應(yīng)條帶,說明所制備的抗mRig-I-H抗體可與所表達(dá)的目的蛋白結(jié)合并且特異性較好(圖4B)。

2.5 用制備的多抗檢測RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的Rig-I蛋白 LPS刺激后能使RAW264.7細(xì)胞中Rig-I表達(dá)量上調(diào)[14,15]。以制備的抗mRig-I-H免疫兔血清作為一抗,Western blot結(jié)果顯示:LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞蛋白在大小約116 kD處出現(xiàn)了特異蛋白條帶,而在未加LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞蛋白中未見有反應(yīng)條帶,說明所制備的抗mRig-I-H抗體能夠與細(xì)胞中Rig-I全蛋白特異性結(jié)合。以制備的抗mRig-I-H免疫兔血清作為一抗,以山羊抗兔IgG-FITC作為二抗,細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示:LPS誘導(dǎo)RAW264.7后,細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)非常明顯的綠色熒光,而在未加LPS誘導(dǎo)的RAW264.7,無綠色熒光出現(xiàn)(圖5)。

2.6 激光共聚焦顯微鏡檢測Rig-I蛋白的亞細(xì)胞定位 為了確定Rig-I在巨噬細(xì)胞中的定位情況,實驗用制備的mRig-I-H多抗對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的Rig-I蛋白的表達(dá)位置進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,在這兩種細(xì)胞內(nèi),Rig-I蛋白主要以游離的方式分布在細(xì)胞質(zhì)中,其中部分Rig-I蛋白會在膜的局部出現(xiàn)點狀形式的聚集(圖6),而這種聚集極有可能對Rig-I所參與的免疫調(diào)控功能具有重要意義,該結(jié)果與現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道基本相符。

圖4 純化mRig-I-H蛋白的Western blot檢測Fig.4 Western blot detected to purified mRig-I-H protein by mouseanti-His serum

圖5 使用免疫兔血清檢測RAW264.7中的RIG-I蛋白Fig.5 RIG-I in RAW264.7 detected by polyclonal antibodies by Western blot

圖6 RIG-I蛋白在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)定位Fig.6 RIG-I location of peritoneal macrophages identitied by confocal

3 討論

Rig-I蛋白是近年新發(fā)現(xiàn)的一種天然免疫受體,其生物功能的研究已經(jīng)成為免疫領(lǐng)域的一個熱點。除了抗病毒作用,一些研究還表明,Rig-I對LPS刺激巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌有促進(jìn)作用,Rig-I基因敲除以后的小鼠頻繁出現(xiàn)類似結(jié)腸炎的癥狀,Rig-I對粒細(xì)胞的增殖有負(fù)調(diào)控作用[15-17]。這些現(xiàn)象的出現(xiàn)提示我們,Rig-I可能在免疫功能調(diào)控中發(fā)揮了十分重要的作用,因此深入開展Rig-I結(jié)構(gòu)與功能調(diào)控作用的研究,將具有十分重要的意義。

抗體是研究基因功能的重要工具,制備一種效價高、特異性好的抗體,是研究相關(guān)基因表達(dá)、定位和生物學(xué)功能非常重要的一步。本實驗室在克隆mRig-I-H基因片段的基礎(chǔ)上,表達(dá)并純化了Rig-I蛋白的C端Helicase結(jié)構(gòu)域,免疫兔制備抗體,經(jīng)過3次免疫強化,ELISA顯示該抗體具有較高的效價。Western blot結(jié)果表示該抗體可與小鼠巨噬細(xì)胞株Raw264.7中分子量約116 kD的蛋白條帶結(jié)合(能較特異性地與Rig-I蛋白結(jié)合)。激光共聚焦實驗證實該抗體同樣可用于Rig-I在細(xì)胞中的定位研究。

本研究利用割膠回收的融合蛋白進(jìn)行抗體制備,方法操作簡便,獲得的抗原量較大。且抗體制備過程具有周期較短、成本低;產(chǎn)生的抗體效價高、特異性強;可用于酶聯(lián)免疫吸附試驗、免疫印跡、免疫組化實驗來檢測Rig-I全蛋白。多克隆抗體的制備成功為進(jìn)一步闡明Rig-I通路提供了重要工具。我們將進(jìn)一步深入研究 Rig-I功能及在免疫反應(yīng)中的作用、調(diào)控機理,從而加快這一領(lǐng)域的研究進(jìn)程。

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