張 慧，林海萍，盛恩浩，厲 亮，胡樹恒，毛勝鳳*

（1. 浙江省臨安市林業(yè)科學(xué)研究所，浙江 臨安 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；3. 浙江省臨安市林業(yè)局，浙江 臨安 311300；4. 浙江省臨安市昌化林業(yè)站，浙江 臨安 311300；）

隨著人們生活水平的不斷提高，對食品提出了更高的要求，食品工業(yè)因此獲得了迅猛的發(fā)展。食品工業(yè)的關(guān)鍵問題之一是防腐保鮮，延長保存期，添加防腐劑是其重要措施之一。天然食品防腐劑作為一類新型安全高效的防腐劑，已成為食品科學(xué)研究的熱點之一，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用動物、植物、微生物或其代謝產(chǎn)物等為原料，經(jīng)提取、酶法轉(zhuǎn)化或者發(fā)酵等技術(shù)生產(chǎn)的天然抗菌物質(zhì)會越來越多[1～2]。天然食品防腐劑也是今后防腐劑市場的主要方向。

竹葉在我國具有悠久的藥用和食用歷史，是中醫(yī)一味著名的清熱解毒藥[3]。最新的研究結(jié)果表明，竹葉中含有大量的黃酮類化合物和生物活性多糖等有效成分，其中的酚酸類化合物、蒽醌類化合物、萜類內(nèi)酯和生物堿等都有著較強的抑菌殺菌作用[4]。國內(nèi)外竹葉系列產(chǎn)品已上市，將其制成片狀、粉劑、膠囊以及飲料等降血脂、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫力、清熱解毒、抗菌防癌等藥品、功能性食品及食品添加劑[5]。竹葉是一種比銀杏葉資源量大而廉價的林業(yè)資源，前景廣闊，但目前應(yīng)用較少，有待進(jìn)一步開發(fā)利用。

本研究以箬竹（Indocalamus tessellatus）葉水提取物和丙酮提取物對大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、八疊球菌（Sarcina）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium）、木霉（Trichoderma）的抑菌活性進(jìn)行研究，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、八疊球菌、黑曲霉、青霉、木霉菌種均來自浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院森林保護(hù)實驗室。

1.1.2 主要儀器 JASON-1型真空泵（美國GAST）；303A-4型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（南京大冉科技有限公司）；DKZ-1型電熱恒溫振蕩水槽（上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司）；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1001S型（日本Eyela）；FA1004型電子天平（南京東邁科技儀器有限公司）；FK-A組織搗碎機（金壇市晶玻實驗儀器廠）。

1.1.3 主要試劑 牛肉膏（分析純）、蛋白胨（分析純）、氯化鈉（分析純）、蔗糖（分析純）、瓊脂條（食品級）、丙酮（分析純）、鹽酸(分析純)、氫氧化鈉（分析純）、蒸餾水（實驗室自制）等。

1.1.4 培養(yǎng)基

1.1.4.1 細(xì)菌培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。

制作方法：在鍋內(nèi)加水1000 mL，放入牛肉膏3 g、蛋白胨10 g和氯化鈉5 g，放在電爐上加熱。待燒杯內(nèi)各組分溶解后，加入瓊脂15 g，不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解后補足失水，用1 mol/L鹽酸或1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)整pH值到7.2 ～ 7.6，分裝于不同試管，加棉花塞，用高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4.2 霉菌培養(yǎng)基

霉菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

制作方法：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1000 mL煮沸0.5 h，紗布過濾，再加10 ～ 20 g葡萄糖和17 ～ 20 g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，所得濾液分裝于不同試管，加棉花塞，高壓蒸汽滅菌20 min后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

實驗流程：新鮮竹葉→組織搗碎機搗碎→加入丙酮或水→常溫浸泡48 h→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮→溶劑再提取→濃縮液（竹葉防腐劑）。

竹葉丙酮提取液制備：取5 kg的箬竹葉，洗凈晾干用搗碎機搗碎，盛于不銹鋼桶中，加入丙酮（20 L），浸泡48 h得竹葉原提取液。過濾提取液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液，提取溫度控制在38 ～ 48 ℃，然后再用丙酮溶劑提取1次，得實驗用原液。

竹葉水提取液制備：取5 kg的箬竹葉，洗凈晾干后用搗碎機搗碎，盛于不銹鋼桶中，加入蒸餾水（20 L），浸泡48 h得竹葉原提取液。過濾提取液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液，提取時溫度控制在50 ～ 60 ℃，再用蒸餾水提取1次，得實驗用原液。

1.3 抑菌試驗

1.3.1 抑菌圈試驗 抗菌試驗采用濾紙片法，操作步驟如下：

1.3.1.1 菌懸液的制備 試驗菌從 4 ℃冰箱中取出后，接種在新鮮斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、八疊球菌）經(jīng)37℃、24 h，霉菌（黑曲霉、木霉、青霉）經(jīng)28 ℃、24 h恒溫培養(yǎng)活化后，用無菌生理鹽水制備菌原液。吸取l.00 mL菌原液加入9.00 mL無菌生理鹽水中，得到稀釋10倍的菌懸液，依次進(jìn)行梯度稀釋。將不同稀釋度的菌懸液各吸取0.20 mL分別加入到已滅菌冷卻的各自適宜的平板培養(yǎng)基表面，涂布均勻。按上述條件培養(yǎng)，根據(jù)觀察結(jié)果，選取各自適宜的菌液濃度，要求在該濃度下，菌能長滿整個培養(yǎng)皿且分布均勻。

1.3.1.2 濾紙片的制備 用打孔器將102型新華濾紙制成直徑為5 mm的圓片，放入干燥潔凈的試管內(nèi)，經(jīng)121℃熱滅菌30 min，浸入各提取液及相應(yīng)的提取溶劑中，1 h后取出，無菌條件下晾干備用。

1.3.1.3 抑菌活性測定[6]對細(xì)菌，用無菌吸管吸取各自適宜濃度的菌懸液0.2 mL加在已倒好的平板培養(yǎng)基表面，涂布均勻；對霉菌，用無菌棉簽蘸取霉菌孢子懸液，均勻地涂布在已倒好的平板培養(yǎng)基表面。用無菌鑷子夾取已制備好的濾紙片，放到上述含菌平皿上，每皿3片，細(xì)菌經(jīng)37℃、24 h，霉菌經(jīng)28℃，48 h培養(yǎng)后，量取抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑作為竹葉抑菌活性指標(biāo)，直徑越大抗菌活性越強。

對照組制備：在已涂布好菌液的培養(yǎng)基上放上消毒好的濾紙片，作為空白對照組，每皿對照3片；將消毒過的濾紙片用丙酮處理，放在已涂布好菌液的培養(yǎng)基上，每皿3片作為丙酮培養(yǎng)基。

1.3.2 最小抑制濃度（MIC）試驗 用兩倍稀釋法將竹葉防腐劑稀釋成不同濃度，在各平皿中分別加入2 mL稀釋液和20 mL已熔化的培養(yǎng)基，充分混勻。冷卻凝固后，加入0.2 mL上述菌懸液，涂勻，培養(yǎng)。觀察結(jié)果，以不長菌的竹葉防腐劑的最低濃度為最小抑制濃度（MIC）[7]。

1.3.3 竹葉防腐劑的食物防腐試驗 將不同濃度竹葉抽提液作為抑菌劑加入果品及豆腐干中，自然條件下放置。隔天檢查果品的保存情況，查看是否有變質(zhì)情況；每天對處理過的豆腐干進(jìn)行檢查，做出感官評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌圈測定結(jié)果

由表1可以看出，箬竹竹葉提取物對細(xì)菌都有一定的抑菌效果。箬竹丙酮提取物對大腸桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到12 mm，相對于試劑對照組也大4 mm多，水提物的抑菌圈直徑也達(dá)到了10 mm，說明竹葉提取物對大腸桿菌的抑菌效果是比較明顯的，且受不同試劑提取的影響較小。枯草芽孢桿菌和八疊球菌的丙酮提取物相對于對照組抑菌圈都只大了1 mm左右，但水提物對八疊球菌的抑制作用則很明顯，達(dá)到了20 mm左右，說明不同提取試劑對其影響較大。兩種提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑都在9 ～ 10 mm，說明該菌對提取試劑的影響較小。霉菌的抑菌圈大小變化不大，說明提取液對霉菌的抑菌效果與提取試劑的關(guān)系不大。

從兩種提取液的對這幾種菌的抑菌效果試驗的結(jié)果可以得出，菌種不同，提取液不同，抑菌效果也有比較大的差異。

表1 箬竹丙酮、水提取物抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of Acetone and water extracts of antibacterial of In. tessellates mm

2.2 最小抑制濃度

將濃縮物按2倍稀釋法稀釋，得到表2最小抑制濃度數(shù)據(jù)，其中大腸桿菌的兩種提取液都是稀釋到濃縮液的 0.781%得到最小抑菌濃度，其他幾種細(xì)菌的兩種提取物都差不多，最小抑制濃度都不超過濃縮液的3.125%，表明箬竹葉的提取物在比較低的濃度下能抑制一些常見食品腐敗細(xì)菌。由幾種霉菌的測試結(jié)果表明提取物對霉菌的最小抑制濃度要高于細(xì)菌，并且水提物的最小抑菌濃度普遍高于丙酮提取物，說明丙酮作為提取試劑要比水的效果好很多，但是從成本和安全考慮水要廉價和安全許多。

表2 最小抑制濃度（濃縮液＝100%）Table 2 Minimum inhibitory concentration(concentrated liquid = 100%) %

2.3 食物防腐試驗

由表3可知，對蘋果的保鮮效果最好，箬竹提取物處理比自然放置時間長了一倍；香蕉的保存時間比較短，只比對照組多幾天；葡萄的保存時間水提物比對照組時間長了一倍，丙酮提取物只長了3 d；橘子的保存時間2種提取物處理差不多，都比原始放置下長了10 d左右。

將豆腐干經(jīng)過水、丙酮、箬竹的丙酮提取物和水提取物處理后放在20℃下保存，每天對其作感官評價，結(jié)果如表4所示。

表3 提取物對果品的保鮮時間Table 3 Preservation time for fruit of extracts d

表4 提取物對豆腐干的保鮮感官評價Table 5 Sensory evaluation on dried Doufu kept by extract

由表4可知，兩種提取物對豆腐干的保鮮效果都很明顯，并且丙酮提取物的保鮮效果比水提取物要好。相對于貝殼煅燒物處理的豆腐干的防腐作用，竹葉提取物處理的抑菌時間更長，對食品的腐敗變質(zhì)的抑制效果更好[8]。

3 結(jié)論與討論

（1）箬竹葉提取物對霉菌的抑制作用不是很好，對木霉的抑制作用最差。丙酮提取物對大腸桿菌、水提物對八疊球菌的抑制作用最好。

（2）使用竹葉提取液對幾種菌的最小抑制濃度的試驗表明，相比其他防腐劑其用量少而效果好。

（3）竹葉成分復(fù)雜，其抗菌成分及抗菌機制有待進(jìn)一步研究。一般認(rèn)為竹葉防腐成分可能是對苯二醌及其衍生物、多糖類、黃酮及其酚類[9]。

（4）在果品應(yīng)用上竹葉提取物有較好的防腐保鮮作用，這為竹葉防腐劑的開發(fā)應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。特別是對于一些熱敏性食品，由于其在高溫高壓下殺菌易導(dǎo)致食品品質(zhì)、風(fēng)味、營養(yǎng)等的嚴(yán)重破壞，可通過在其中加入竹葉提取液，避免高溫高壓處理，達(dá)到既防腐又保證食品品質(zhì)、風(fēng)味與營養(yǎng)的效果。

（5）目前在竹葉防腐劑提取方法上還有待更好的完善，尋找一種更簡便高效，且成本低廉的提取方法將為竹葉防腐劑的開發(fā)提供更為有利的條件。

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