姜燕華，段云裳，王麗鴛，周 健，曾建明，成 浩*

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家茶樹(shù)改良中心，浙江 杭州 310008；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095）

福建省茶樹(shù)栽培歷史悠久，是我國(guó)茶樹(shù)無(wú)性系品種的起源地。廣大茶農(nóng)在長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐中，篩選和培育了大批的無(wú)性系地方（農(nóng)家）品種。這些地方品種中的部分優(yōu)異者，如福鼎大白茶、政和大白茶、黃惔等在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用和分布較廣，1985年被全國(guó)農(nóng)作物品種審定委員會(huì)認(rèn)定為第一批國(guó)家級(jí)良種，其中部分品種在20世紀(jì)60年代后被推廣引種到全國(guó)各地的產(chǎn)茶省份，并成為各地茶樹(shù)育種機(jī)構(gòu)所經(jīng)常采用的育種親本。同時(shí)，近幾十年來(lái)，福建省還采用單株選育、雜交等方法培育了福云系列、鐵觀音黃惔系列等一大批茶樹(shù)良種，是我國(guó)茶樹(shù)育成品種數(shù)較多的省份之一[1～5]。

分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。目前已經(jīng)發(fā)展出多種標(biāo)記方法，如RAPD、ISSR、SSR等，這些標(biāo)記不僅在水稻[6]、小麥[7]等農(nóng)作物上，還在馬蘭[8]、朱砂根[9]等藥科植物上得到廣泛應(yīng)用。SSR（simple sequence repeats）標(biāo)記又稱(chēng)微衛(wèi)星（microsatellite）標(biāo)記，是由1 ～ 6個(gè)核苷酸組成的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物基因組中。SSR標(biāo)記具備多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、共顯性和易于使用等特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣的分子標(biāo)記之一。在茶樹(shù)物種研究中，多種分子標(biāo)記都得到一定應(yīng)用[10～11]，我國(guó)茶樹(shù) SSR標(biāo)記的建立始于金基強(qiáng)等人[12]的研究。隨后，茶樹(shù) SSR標(biāo)記得到快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。姚明哲等[13]采用EST-SSR引物對(duì)我國(guó)江北茶區(qū)進(jìn)行多態(tài)性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，認(rèn)為種質(zhì)資源沒(méi)有出現(xiàn)明顯的地區(qū)分化；王麗鴛等[14]利用SSR標(biāo)記對(duì)茶組資源間親緣進(jìn)化進(jìn)行研究，構(gòu)建出茶組12個(gè)種的遺傳進(jìn)化關(guān)系圖；劉振等[15]通過(guò)EST-SSR標(biāo)記對(duì)福建省茶樹(shù)資源多態(tài)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)福建省茶樹(shù)資源具有較高的遺傳多樣性；而黃建安等[16]將毛細(xì)管電泳四色熒光檢測(cè)技術(shù)與SSR標(biāo)記結(jié)合，使得SSR標(biāo)記在茶樹(shù)上的應(yīng)用更為方便和可靠，且成本大大降低。但目前采用SSR標(biāo)記來(lái)探討人為選擇對(duì)我國(guó)茶樹(shù)品種多態(tài)性影響的系統(tǒng)分析還沒(méi)有。

本文采用SSR分子標(biāo)記方法，對(duì)福建省茶樹(shù)地方品種和育成品種的親緣關(guān)系和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，并討論人為選擇對(duì)茶樹(shù)品種遺傳多態(tài)性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

60份試驗(yàn)材料（表1）來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國(guó)家茶樹(shù)種質(zhì)資源圃和福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所種質(zhì)資源圃，包括31份地方品種（其中15份經(jīng)國(guó)家或省級(jí)審（認(rèn)）定）和29份近代育成品種（系）[5,17]。于4月下旬采集一芽二葉新梢，置－80℃冰箱中備用。

表1 參試茶樹(shù)品種名稱(chēng)和來(lái)源Table 1 Name and origin of the tested 60 tea varieties

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 將材料于液氮條件下研磨成細(xì)粉，參照劉本英[18]CTAB法進(jìn)行改進(jìn)提取基因組DNA。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳定性檢測(cè)所提DNA，用Shimadzu UV2550（日本津島公司）分光光度儀定量檢測(cè)純度和濃度，最后將DNA濃度稀釋標(biāo)定到20 ng/μL，置于－20℃冰箱備用。

1.2.2 引物確定 引物由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶樹(shù)資源與改良中心自主開(kāi)發(fā)，選取多態(tài)性較好的36對(duì)SSR引物用于本次實(shí)驗(yàn)標(biāo)記，部分引物信息見(jiàn)表2及王麗鴛等人研究[19]。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表2 部分EST-SSR引物信息Table 2 Information of parts of EST-SSR primer pairs

1.2.3 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)總體積10.0 μL，在PTC-200型PCR儀（MJ Research, Inc., Waltham, MA, USA）上進(jìn)行，具體反應(yīng)步驟為：94℃預(yù)變性4 min→35個(gè)循環(huán)的變性（94℃ 30s）→退火（溫度隨引物不同而不同，45s）→延伸（72℃ 30s）→72℃下繼續(xù)延伸10 min→4℃保溫[20]。

1.2.4 產(chǎn)物檢測(cè) 采用 10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離檢測(cè)，在 Bio-Rad 300型電泳儀（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）上電壓設(shè)定為160 V，時(shí)間150 min，電泳結(jié)果用銀染檢測(cè)。用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)同一個(gè)SSR引物的擴(kuò)增條帶（等位變異）在各參試資源中記錄有或無(wú)。同一位置條帶如果無(wú)或模糊不易分辨，則記為“0”；如果有清晰條帶，則記為“1”，用 Excel表存儲(chǔ)，再按照各種不同的軟件進(jìn)行相應(yīng)格式的轉(zhuǎn)換。

參試資源某一位點(diǎn)的等位基因數(shù)（na）、有效等位基因數(shù)（ne）、期望雜合度（He）、Nei氏多樣性指數(shù)（Nei）、平均遺傳距離（Mean. D）以及Shannon信息指數(shù)（I）等數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)在Popgene 1.32軟件包中完成；基因型（GenoType）和多態(tài)性信息含量（PIC）在Powermarker Ver.3.25中完成；根據(jù)Nei氏遺傳距離，按非加權(quán)類(lèi)平均法（unweighted pair group method with arithmetic averaging, UPGMA），采用Popgene 1.32軟件結(jié)合MEGA 3.1分析軟件[21～22]對(duì)60份參試材料進(jìn)行聚類(lèi)并繪制聚類(lèi)圖。

采用structure2.3軟件對(duì)60份供試材料進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，按照似然值最大的原則選取合適的K值，得到基于模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖[23～24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 參試材料的多態(tài)性分析

采用36對(duì)SSR引物對(duì)60份材料進(jìn)行多態(tài)性分析，共檢測(cè)到165條多態(tài)性條帶，平均每對(duì)引物檢測(cè)到4.58條（圖1）；所得基因型共343個(gè)，平均為9.53個(gè)；平均多態(tài)信息量（PIC）0.54。

將參試材料分為基本未獲推廣應(yīng)用的未審（認(rèn)）定地方品種、品質(zhì)性狀優(yōu)異而獲得較大面積推廣應(yīng)用的審（認(rèn)）定地方品種和現(xiàn)代育成品種3類(lèi)，分別計(jì)算他們的多態(tài)性數(shù)據(jù)，并將生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的審（認(rèn)）定地方品種和現(xiàn)代育成品種合并作為一組，并計(jì)算了多態(tài)性各項(xiàng)數(shù)據(jù)。其結(jié)果（表 3）表明，前三組的多態(tài)性從高到低依次為未審（認(rèn)）定地方品種＞育成品種＞審（認(rèn)）定地方品種。而后兩組合并成推廣應(yīng)用品種組后，其多態(tài)性結(jié)果仍低于未審（認(rèn)）定地方品種組。但是，現(xiàn)代育成品種間的平均遺傳距離卻大于地方品種間的平均遺傳距離。

圖1 引物A58對(duì)60份福建茶樹(shù)材料的擴(kuò)增電泳圖Figure 1 The amplification result of primer A58 for the 60 tea varieties from Fujian

2.2 參試材料的親緣關(guān)系分析

由60份參試資源的聚類(lèi)結(jié)果（圖2）表明，在分支長(zhǎng)度為 0.2883時(shí)，參試材料被劃分為A1和A2兩大類(lèi)。

其中A1大類(lèi)所聚的 15份供試材料全部屬于未審（認(rèn)）定的地方品種，如矮腳烏龍、臘面和張儀等；A2大類(lèi)包括的是在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用較多的國(guó)家（?。┘?jí)審（認(rèn)）定地方品種和現(xiàn)代育成品種，這一大類(lèi)中還出現(xiàn)了4個(gè)聚集較為緊密的小亞群，其中B類(lèi)主要為福鼎大白茶與云南大葉茶的雜交后代如福云6號(hào)、7號(hào)等，以及與福鼎有關(guān)的一些品種如福鼎大毫茶、早逢春、霞浦春波綠；D1類(lèi)大部分是鐵觀音和黃棪的雜交后代如黃觀音、黃玫瑰、紫玫瑰等，和鐵觀音同樣來(lái)自于安溪的鳳圓春，以及兩個(gè)來(lái)自武夷山的品種九龍袍和丹桂；而D2類(lèi)中大部分是原產(chǎn)于安溪縣獲國(guó)家級(jí)認(rèn)定的地方品種，如毛蟹、鐵觀音、黃棪等。

60份供試材料中遺傳距離最大的是大紅和紅芽佛手，都屬于地方品種，為1.87。而黃玫瑰和紫玫瑰由于遺傳背景非常接近[25]，他們之間的遺傳距離最小，只有0.02。

圖2 60份茶樹(shù)材料的UPGMA聚類(lèi)圖Figure 2 Dendrogram of PopGen cluster

2.3 參試材料的遺傳結(jié)構(gòu)分析

遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，當(dāng)K = 2時(shí)，能夠取到最大似然值，此時(shí)供試材料被分為兩大類(lèi)群：I亞群和Ⅱ亞群（圖3），兩大亞群分離明顯，具有明顯的結(jié)構(gòu)差異。

其中第I亞群包括15份供試材料，占總參試材料的25%，全部為未審（認(rèn)）定地方品種，與聚類(lèi)分析結(jié)果中的A1類(lèi)完全一致；剩下的45份參試資源分布于亞群Ⅱ，占總數(shù)的75%。

圖3 60份材料的遺傳結(jié)構(gòu)Figure 3 The genetic structure of 60 tea germplasms from Fujian

3 討論

本文采用的聚類(lèi)分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析都將60份參試材料以相同的方式分成了兩大類(lèi)，第一大類(lèi)囊括了15個(gè)未經(jīng)審定的地方品種，這些品種資源的共同特點(diǎn)是在生產(chǎn)實(shí)踐上獲得的認(rèn)可度較低，因而沒(méi)有獲得規(guī)?；耐茝V應(yīng)用。而另一大類(lèi)則包括了在生產(chǎn)中獲得了較大規(guī)模推廣應(yīng)用的、已經(jīng)獲得國(guó)家或省級(jí)審（認(rèn)）定的地方品種和其他所有的現(xiàn)代育成品種，這些品種的共同特點(diǎn)是其品質(zhì)性狀都較為符合近現(xiàn)代茶葉生產(chǎn)的需求，獲得茶葉生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者認(rèn)同度較高。因此，這樣兩種來(lái)源的品種被歸入同一大類(lèi)的原因之一，可能就在于他們都是經(jīng)歷了較為強(qiáng)烈的人為篩選后所留下的幸運(yùn)兒，而這些人為篩選的目標(biāo)或者標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)槎际且陨a(chǎn)實(shí)際為指導(dǎo)的，因而是基本相同或近似的，由此導(dǎo)致了他們?cè)谳^多的性狀位點(diǎn)上趨于同質(zhì)化。這兩類(lèi)品種材料的多態(tài)性指標(biāo)數(shù)值低于未經(jīng)審（認(rèn)）定地方品種組的事實(shí)，同樣表明了他們遺傳多樣性程度的被降低。

表3 不同類(lèi)型品種的多態(tài)性比較Table 3 Polymorphic comparison among different groups

審（認(rèn)）定地方品種和現(xiàn)代育成品種被歸入同一大類(lèi)的另一個(gè)影響因素可能來(lái)自于以下事實(shí)，在29個(gè)育成品種中，多數(shù)（19個(gè)）都與福鼎大白茶、鐵觀音和黃惔這三個(gè)地方品種中的一個(gè)或兩個(gè)有親緣關(guān)系，它們或者是這三個(gè)地方品種的雜交后代，或者是從這三個(gè)地方的種子后代中篩選出來(lái)的，因而使得這兩類(lèi)材料間的遺傳背景變得更為相近。但是，另一方面，來(lái)自于云南的云南大葉茶作為雜交親本的引入，可能是導(dǎo)致育成品種間平均遺傳距離增大的原因。因此，從以上分析可以看出，帶有相同或相似目的的人為選擇，確實(shí)降低了生產(chǎn)上推廣使用的茶樹(shù)品種的遺傳多樣性。

致謝：在研究過(guò)程中得到了福建省茶葉研究所郭吉春研究員的大力幫助，在此謹(jǐn)表謝意。

[1]葉乃興，郭吉春. 福建茶樹(shù)品種資源的研究現(xiàn)狀與展望[J]. 福建茶葉，1997（1）：42－45.

[2]葉乃興，楊如興，郭吉春，等. 福建茶樹(shù)遺傳資源的多樣性和品種創(chuàng)新[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，33（2）：174－177.

[3]陳宗懋. 中國(guó)茶葉大辭典[M]. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2008.

[4]杜起洪. 福建省茶樹(shù)良種優(yōu)勢(shì)面臨的新問(wèn)題[J]. 福建茶葉，1999（2）：35－37.

[5]中國(guó)茶樹(shù)品種志編寫(xiě)委員會(huì). 中國(guó)茶樹(shù)品種志[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社. 2001.

[6]張曉麗，郭輝，王海崗，等. 中國(guó)普通野生稻與栽培稻種SSR多樣性的比較分析[J]. 作物學(xué)報(bào)，2008，34（4）：591－597.

[7]沈裕琥，竇全文，王海慶，等. SSR水平上甘、青兩省春小麥品種間的遺傳多樣性現(xiàn)狀及演變趨勢(shì)[J]. 西北植物學(xué)，2003，23（10）：1755－1761.

[8]葉榮華，劉躍鈞，斯金平，等. 馬蘭種質(zhì)遺傳多樣性的研究[J]. 浙江林業(yè)科技，2008，28（3）：39－42.

[9]袁德義，何小勇，莫文娟，等. 朱砂根ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 浙江林業(yè)科技，2008，28（4）：60－62.

[10]王麗鴛，成浩，周健. 茶樹(shù)DNA分子標(biāo)記及基因工程研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué)，2004，24（1）：12－17.

[11]劉本英，王麗鴛，周健，等. 云南大葉種茶樹(shù)種質(zhì)資源ISSR指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2008，9（4）：458－464.

[12]金基強(qiáng)，崔海瑞，陳文岳，等. 茶樹(shù)EST-SSR的信息分析與標(biāo)記建立[J]. 茶葉科學(xué)，2006，26（1）：17－23.

[13]姚明哲，劉振，陳亮，等. 利用EST-SSR分析江北茶區(qū)茶樹(shù)資源的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)[J]. 茶葉科學(xué)，2009，29（3）：243－250.

[14]王麗鴛，劉本英，姜燕華，等. 用SSR分子標(biāo)記研究茶組植物種間親緣進(jìn)化關(guān)系[J]. 茶葉科學(xué)，2009，29（5）：341－346.

[15]劉振，姚明哲，王新超，等. 基于EST-SSR的福建地區(qū)茶樹(shù)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（5）：1720－1727.

[16]黃建安，李娟，譚月萍，等. 毛細(xì)管電泳四色熒光檢測(cè)法分析茶樹(shù)SSR標(biāo)記[J]. 生命科學(xué)研究，2009，13（3）：251－257.

[17]江用文. 國(guó)家種質(zhì)資源圃保存資源名錄[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社. 2005. 711－781.

[18]劉本英，王平盛，周紅杰，等. 云南茶組植物ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（增）：21－25.

[19]王麗鴛，姜燕華，段云裳，等. 茶樹(shù)EST-SSR分布特征及引物開(kāi)發(fā)[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2009，10（4）：511－516.

[20]劉振，王新超，趙麗萍，等. 基于EST-SSR的西南地區(qū)茶樹(shù)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析[J]. 分子植物育種，2008，6（1）：100－110.

[21]Kumar S，Tamura K，Nei M. MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]. Brief Bioinfor，2004，5（2）：150－163.

[22]Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J]. Genetics，1978（89）：583－590.

[23]張軍，趙團(tuán)結(jié)，蓋鈞鎰. 中國(guó)東北大豆育成品種遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[J]. 作物學(xué)報(bào)，2008，34（9）：1529－1536.

[24]Pritchard J K，Stephens M，Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data[J]. Genetics，2000（155）：945－959.

[25]葉乃興. 我國(guó)茶樹(shù)育種的骨干親本及其系譜分析[J]. 中國(guó)茶葉，2008（4）：11－13.