紀(jì)麗莎，殷紅福，汪麗芬，張先福

（浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安311300）

鴨疫里氏桿菌Riemerella anatipestifer病，也稱(chēng)鴨傳染性漿膜炎，是鴨的一種細(xì)菌性傳染病，死亡率達(dá)30%～50%。該病以纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎、輸卵管炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等為主要病變特征［1－2］。鴨疫里氏桿菌具有21個(gè)血清型，各血清型相互之間沒(méi)有交叉免疫力，免疫預(yù)防效果不佳［3－5］；且鴨疫里氏桿菌對(duì)各類(lèi)抗生素極易產(chǎn)生耐藥性［6－7］，在很多地區(qū)已經(jīng)難以找到對(duì)鴨疫里氏桿菌敏感的藥物。鑒于此，我們前期試驗(yàn)篩選出對(duì)鴨疫里氏桿菌病具有顯著效果并由黃連Coptis chinensis，黃柏Phellodendrion amurense和甘草Glycyrrhiza uralensis 3味中藥組成的中藥復(fù)方黃連湯［8］。經(jīng)HPLC 測(cè)定，黃連湯有效成分分別為小檗堿 299.73 mg·kg－1，藥根堿 108.66 mg·kg－1，甘草酸 9.00 mg·kg－1，鹽酸小檗堿 5.7 g·kg－1，鹽酸巴馬汀 254.00 mg·kg－1（中草藥已錄用）。為了進(jìn)一步研究黃連湯對(duì)鴨疫里氏桿菌中外膜蛋白的作用，本研究開(kāi)展了黃連湯提取物對(duì)鴨疫里氏桿菌的抑菌率研究，為中藥抗菌機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材 黃連、黃柏和甘草均購(gòu)自浙江省臨安市中醫(yī)院。

1.1.2 菌株及試劑 鴨疫里氏桿菌，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所提供，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）［9］作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制固體培養(yǎng)基時(shí)，另按15 g·kg－1加瓊脂粉，制成胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）。

1.1.3 儀器與設(shè)備 UV-2450型精密紫外分光光度計(jì)（島津國(guó)際貿(mào)易有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠），全自動(dòng)高壓滅菌鍋（廣州東南科儀有限公司）

1.2 方法

1.2.1 中藥原料處理 采用水提醇沉法：取黃連2 g，黃柏2 g，甘草4 g放入燒杯中，加適量的水，浸泡，煮沸后用小火持續(xù)20～30 min（視藥物而定）；濾出煎液，濾渣加水，進(jìn)行第2次煎煮（20～30 min）；濾出煎液，合并2次濾液，用紗布過(guò)濾，得濾液75.0 mL，加入體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇225 mL，4℃下靜置24 h，濾紙過(guò)濾除沉淀，在75℃下減壓回收乙醇，85℃下繼續(xù)濃縮得原藥34.8 mL，藥液含生藥229.9 g·L－1，微孔濾膜過(guò)濾除菌后，放置在－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鴨疫里氏桿菌的復(fù)蘇和菌懸液的制備［10］在TSB肉湯培養(yǎng)基中加入15 g·kg－1瓊脂，加熱溶解，121℃高壓滅菌20 min，傾倒在平板培養(yǎng)皿內(nèi)，以此用作凍干菌株的復(fù)蘇平板培養(yǎng)基。利用平板劃線法將凍干菌株接種至平板內(nèi)，37℃，培養(yǎng)24 h后，挑取單個(gè)生長(zhǎng)的菌落，轉(zhuǎn)種至TSB肉湯培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12 h。此為菌懸液。

1.2.3 擴(kuò)增培養(yǎng) 取培養(yǎng)12 h的菌懸液100 μL，加至裝有TSB的肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱，分別培養(yǎng)0，2，4，6，8和10 h，對(duì)各個(gè)時(shí)間段的生長(zhǎng)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并測(cè)定吸光度值。

1.2.4 菌落計(jì)數(shù)和吸光度值的相關(guān)性分析 采用平板菌落計(jì)數(shù)法［11］。將定時(shí)培養(yǎng)的菌液進(jìn)行10－1，10－2，10－3，…，10－7，10倍遞增稀釋?zhuān)缓蠓謩e取不同稀釋度的菌液100 μL滴加于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）平板上，用無(wú)菌涂棒涂布均勻，每個(gè)稀釋度重復(fù)3塊平板，37℃溫箱中培養(yǎng)12 h。統(tǒng)計(jì)平板上生長(zhǎng)的活菌數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以10，即為菌濃度（×1010個(gè)·L－1）。定時(shí)吸取適量菌液和參比液，將參比液調(diào)0后，測(cè)定菌懸液的吸光度DO600。該試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 藥物稀釋與菌液接種 取無(wú)菌試管，將黃連湯原液與培養(yǎng)基按照1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7的體積比稀釋?zhuān)幬镔|(zhì)量濃度分別為115.0，77.0，57.0，46.0，38.0，33.0和29.0 g·L－1，分別放置到各個(gè)試管中。接種菌懸液20，50，120，190和250 μL到各組配制好的試管藥液中。置于37℃，180 r·min－1的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h。該試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。另取1支含菌懸液的試管作對(duì)照，此為凈生長(zhǎng)量。

1.2.6 抑制生長(zhǎng)率的計(jì)算 將不同藥物的光密度值代入到鴨疫里氏桿菌生長(zhǎng)曲線的線性關(guān)系方程式中，計(jì)算抑制生長(zhǎng)率。抑制生長(zhǎng)率=（細(xì)菌凈生長(zhǎng)量－處理凈生長(zhǎng)量）/細(xì)菌凈生長(zhǎng)量×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果用Excel處理，用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析和回歸分析［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨疫里氏桿菌濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

細(xì)菌在培養(yǎng)了0，2，4，6，8和10 h后，取3.0 mL細(xì)菌懸液與參比液，進(jìn)行吸光度DO600測(cè)定，以吸光度為橫坐標(biāo)，以菌濃度為縱坐標(biāo)（ × 1010個(gè)·L－1），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［13］（圖1）。

曲線方程為y=0.485 1e1.9068x，R2=0.981 1。將其化為線性模型后進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，得F=156.006＞F0.01（1，3） =34.1，說(shuō)明在 0.01 水平上兩者相關(guān)性顯著，線性關(guān)系良好。

圖1 鴨疫里氏桿菌的吸光度和菌濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Curve between OD values and the concentration of Riemerella anatipestifer

2.2 不同質(zhì)量濃度中藥浸提物對(duì)不同菌量的抑制效果

通過(guò)肉眼觀察，菌量為20 μL時(shí)藥物質(zhì)量濃度在33.0 g·L－1時(shí)液體出現(xiàn)混濁，38.0 g·L－1時(shí)有絮狀物；菌量在50和120 μL時(shí)，藥物質(zhì)量濃度大于38.0 g·L－1時(shí)液體較清澈，但46.0 g·L－1有絮狀物；菌量在190和250 μL時(shí)，藥物質(zhì)量濃度在38.0 g·L－1時(shí)，液體出現(xiàn)混濁，在57.0和46.0 g·L－1都有絮狀沉淀，但57.0 g·L－1透明度大于46.0 g·L－1。從結(jié)果可以看出，黃連湯有抑菌效果，但其抑制效果不能得出確切數(shù)值。現(xiàn)通過(guò)定量的方法來(lái)測(cè)定抑制率。紫外分光光度計(jì)測(cè)定各菌量的吸光度值見(jiàn)表1。

表1 不同藥物質(zhì)量濃度下對(duì)應(yīng)的吸光度Table 1 OD values of various drug concentrations corresponding

從表1中可以看出，除第7組外，隨著藥物質(zhì)量濃度的增大，吸光度依次遞減，抑制率依次增大，但第7組的吸光度值小于第6組。將以上吸光度值數(shù)據(jù)代入到曲線方程中，得到各吸光度對(duì)應(yīng)的菌濃度（表2）。

由表2說(shuō)明，藥物質(zhì)量濃度在29.0 g·L－1時(shí)，95%的菌已經(jīng)被抑制。菌濃度小于0.7×1010個(gè)·L－1時(shí)，液體已經(jīng)處于澄清透明。橫向?qū)Ρ?，除?組和第2組外，第3組到第7組隨著菌量的增加，菌濃度依次增大。將以上菌濃度通過(guò)抑菌生長(zhǎng)率公式求得各質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)的抑菌率（表3）。

通過(guò)上表可見(jiàn)，通過(guò)縱向?qū)Ρ?，菌量?0和50 μL時(shí)，藥物質(zhì)量濃度的顯著性差異出現(xiàn)在第3組，菌量在120，190和250 μL時(shí)，藥物質(zhì)量濃度的顯著性差異出現(xiàn)在第4組，與肉眼觀察不相吻合。各個(gè)菌量的抑菌率分別為99.99%，99.98%，99.99%，99.98%和99.98%，抑菌率都在99.98%以上。

表2 藥物質(zhì)量濃度作用下對(duì)應(yīng)的菌濃度Table 2 Bacterial content of under the action of various drug concentrations

表3 黃連湯有效部位抑菌率Table 3 Antibacterial rate of ethanol extracts of Coptidis rhizoma Decoction against Riemerella anatipestifer

3 討論

從表1中可以看出，除第7組外，其余藥物質(zhì)量濃度組隨著藥物質(zhì)量濃度的增大，吸光度值依次遞減，抑制率依次增大，但第7組的吸光度值小于第6組。藥物質(zhì)量濃度在77.0 g·L－1時(shí)抑菌效果最佳。試驗(yàn)說(shuō)明，藥物質(zhì)量濃度越大抑制細(xì)菌的效率反而會(huì)減弱，可能因?yàn)橹兴幨怯啥喾N復(fù)雜成分構(gòu)成，不是所有成分都直接作用于致病菌達(dá)到抑制細(xì)菌的目的，有些成分會(huì)因?yàn)樗幬镔|(zhì)量濃度的增高起到自身抑制的效果，故中藥的抑制率反而會(huì)減少，甚至有些中藥的抗菌有效成分在體外抑菌試驗(yàn)中測(cè)不出或顯示不強(qiáng)，但在體內(nèi)卻有較好的抑菌效果（如魚(yú)腥草Houttuynia cordata）［14］。前期試驗(yàn)已經(jīng)證明，鴨疫里氏桿菌對(duì)人工發(fā)病鴨具有顯著的治療效果。

通過(guò)肉眼觀察，菌量為20，50，120，190和250 μL時(shí)，對(duì)應(yīng)的含有絮狀物的藥物質(zhì)量濃度分別為38.0，46.0，46.0，57.0和57.0 g·L－1。由表2的數(shù)值可以看出，絮狀物都出現(xiàn)在0.5×1010～0.6×1010個(gè)·L－1，是抑制與非抑制的臨界值，可能是細(xì)菌在生長(zhǎng)時(shí)與藥物對(duì)抗直至被殺死后所產(chǎn)生細(xì)菌死亡之后的菌體變?yōu)樾鯛钗?，而大于臨界值的細(xì)菌未被抑制住，會(huì)使菌液混濁；小于臨界值的細(xì)菌被藥物抑制，使液體澄清透明。死亡之后的菌體給實(shí)驗(yàn)人員的判讀帶來(lái)了不便的影響，測(cè)定細(xì)菌吸光度值，具有定量準(zhǔn)確、方法簡(jiǎn)便及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

通過(guò)表2可以看出，在20 μL菌量時(shí)，第1組的菌濃度為227×1010個(gè)·L－1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組5 017×1010個(gè)·L－1，抑制率為95.00%。同樣，在第2組里，只有24×1010個(gè)·L－1個(gè)細(xì)菌。這可能是因?yàn)樗幬镒饔煤螅?xì)菌崩解，破裂，胞質(zhì)流出，體積變小，減少了混濁度，從而減少了吸光度。這說(shuō)明藥量在很少的情況下，都有很大的抑制效果。下一步做藥物對(duì)細(xì)菌外膜蛋白的提取時(shí)，選藥物質(zhì)量濃度為 29.0 g·L－1的即可。

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