沈 偉 張征軍 孫 杰 邵平揚 王志剛/. 浙江省嘉興市計量檢定測試所；. 浙江省嘉興市第二醫(yī)院

建立銪原子標記技術(shù)對實驗室移液器容量的比對與校準，能實現(xiàn)對小容量移液器容量準確度與精密度的有效監(jiān)控。采用時間分辨熒光檢測技術(shù)，檢驗移液器容量的誤差來源。時間分辨熒光法檢測批內(nèi)重變性誤差在0.17%～7.8%之間。銪標記法與蒸餾水稱重法對移液器容量測定的比對試驗，相對誤差-3.9%～0.62%。時間分辨熒光進行移液器容量比對與誤差評估，方法靈敏、精確、簡便, 可適用于臨床實驗室移液器容量的誤差識別及常規(guī)比對。

0 引言

移液器、進樣器是利用空氣排代原理的量出式加樣器，是臨床實驗室定性與定量分析的常用工具，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、分子生物學(xué)、色譜分析等技術(shù)領(lǐng)域，其容量的準確性直接關(guān)系到結(jié)果的可靠性、可比性與可重復(fù)性[1]。據(jù)報道新購置的移液器失準率為1.56%，則使用1萬次以下的失準率為4%，（1～5）萬次失準率為8.82%，（5～10）萬次失準率為21.7%，10萬次以上失準率為47.6%[2]。故對移液器進行誤差檢驗，既是各實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制的必要條件，又是實現(xiàn)實驗室之間檢驗、檢查結(jié)果“一單通”的技術(shù)前提。

目前，移液器的容量檢定有重量分析法和分光光度法兩種[3、4]，我們在實際工作中成功探索出用銪原子標記技術(shù)對移液器的容量進行誤差識別，并獲國家發(fā)明專利。該方法將銪標記技術(shù)的高靈敏性與高穩(wěn)定性結(jié)合起來，不受氣溫、氣壓的影響，檢測靈敏度達10-12～10-14g/L[5]，精密度試驗顯示優(yōu)異的性能，尤其適用于小容量移液器的容量比對。

1 原理與方法

1.1 實驗原理

時間分辨熒光檢測技術(shù)（time-resolved fluoroimmunoassay, TR-FIA）以鑭系銪原子(Eu)作為示蹤材料（原子序數(shù)63，原子半徑2.56，原子體積28.9 cm3/mol），用β-萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）為熒光增強液，336～337 nm為激發(fā)波長，610～613 nm為測定波長，利用這類熒光物質(zhì)熒光壽命長及Stokes位移大的特點，熒光衰退時間730 μs，測定延時時間400 μs，通過波長和時間差兩種分辨技術(shù)，有效排除非特異本底熒光的干擾，靈敏度高，標記物制備簡單，穩(wěn)定性好。魯赫曼發(fā)射光譜由時間分辨熒光儀測定，測定載體為聚乙烯微孔板。以《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）為判斷標準，建立起精確有效、簡便快速的銪原子標記技術(shù)對移液器容量精確度進行比對與校準的方法。

1.2 儀器與材料

上海某生物技術(shù)有限公司的ANYTEST時間分辨熒光分析儀，配220 V電壓、50 Hz頻率的穩(wěn)壓電源；上海某儀器廠的TG-328A型光電分析天平；待檢移液器若干。

1.3 實驗準備

1）聚乙烯微孔板本底檢測：空白聚乙烯微孔板在時間分辨熒光分析儀上進行本底測定。

2）銪原子標記液制備：上海某生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的銪標記試劑盒，取30 μL銪加3 mL稀釋液混合成銪標記液。

1.4 移液器加樣操作[6] ：

1）溫度平衡：先使移液器、吸液嘴與銪標記液溫度平衡30 min后進行操作。

2）容量設(shè)定：轉(zhuǎn)動移液器頂部調(diào)節(jié)旋鈕，逆時針方向轉(zhuǎn)動，增大加樣量；順時針方向轉(zhuǎn)動，減少加樣量，最終將移液器的容量調(diào)節(jié)到所需刻度。

3）預(yù)吸液：選擇潔凈、合適的滴頭安置在移液器套筒上，稍加扭轉(zhuǎn)壓緊吸液嘴使與套筒之間無空氣間隙。垂直握持移液器，預(yù)吸入銪標記液并排回原容器中，吸液、排液共重復(fù)3次。

4）吸液：垂直握持移液器，把按鈕壓至第一停點，滴頭浸入液面下2～3 mm處,然后緩慢平穩(wěn)地放松按鈕，等1～2 s滴頭完全吸滿后，滴頭離開液面，貼壁停留2～3 s，淌走多余的液體。

5）放液：將移液器移至聚乙烯微孔板側(cè)壁，保持垂直狀態(tài)，輕輕壓下按鈕至第一停點位置，等待1～2 s，移動滴頭再貼試管壁，完全撳下按鈕，以排盡滴頭內(nèi)的液體，然后將滴頭沿試管內(nèi)壁向上移開。

6）動作應(yīng)柔和，避免按鈕急速彈回；實驗操作過程中，移液器始終保持垂直狀態(tài)。

1.5 檢測方法

1）按JJG 646-2006[7]，用重量分析法確定1支移液器作為本次實驗的標準移液器。

2）批內(nèi)精密度試驗：用標準移液器、待檢移液器分別加銪標記液，進行批內(nèi)精密度試驗。

3）容量比對試驗：標準移液器與待檢移液器分別吸取同一銪標記液各10孔，混勻5 min，即時進行熒光時間分辨測定，計算均值、SD、CV%、相對誤差R%。

4）穩(wěn)定性檢測：在即時、15 min、30 min、60 min，分別再次測定熒光強度值。

5）誤差的識別：對CV%值超過《JJG 646 —2006》規(guī)定誤差范圍的移液器應(yīng)棄用—隨機誤差；對CV%小，但R%超范圍的待檢移液器應(yīng)當(dāng)校正—系統(tǒng)誤差。

6）允許誤差范圍設(shè)定：移液器容量允許誤差范圍和重復(fù)性判斷標準，以JJG 646-2006規(guī)定為準。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

相對誤差采用成組設(shè)計的兩樣本均數(shù)的百分比。

2 試驗結(jié)果

2.1 時間分辨熒光批內(nèi)重復(fù)性試驗

在最佳實驗條件下，用已檢定的移液器加銪標記液，進行批內(nèi)重復(fù)性試驗。實驗結(jié)果顯示50 μL、10 μL、5 μL、1 μL批內(nèi)重復(fù)性誤差 分 別 為 0.17%、0.96%～1.80%、1.67%～2.10%、4.80%～7.80%（表 1）。

2.2 穩(wěn)定性檢測

表1 銪標記法對標準移液器的重復(fù)性試驗

在即時、15 min、30 min、60 min，分別再次測定熒光強度值，見圖1。

圖1 穩(wěn)定性試驗

2.3 銪標記法與稱重法測定移液器容量比對

吸取同一銪標記溶液加樣后進行測定，計算均值、SD、CV%及兩者均數(shù)的相對誤差R%（表2）。

2.4 非標準移液器的校準試驗

對CV%值超過《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）規(guī)定誤差范圍的移液器應(yīng)棄用；對CV%小，但R%超范圍的待檢移液器，先做好刻度記號，再用移液器專用扳手調(diào)節(jié)頂部旋鈕,順時針旋轉(zhuǎn)，容量調(diào)大；逆時針旋轉(zhuǎn)，容量調(diào)小，隨后再進行10次標記溶液加樣測定，直至R%小于《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）容量允許誤差范圍之內(nèi),即R%趨向于零。

表2 銪標記法與稱重法比對試驗

3 討論

目前移液器容量比對與校準有兩種方法[8-10]：①國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局推薦的蒸餾水稱重法作為移液器容量校準的標準方法，但該實驗須考慮到氣溫、氣壓條件，同時兼顧濕度與修正值等因素，整個操作比較繁瑣，臨床應(yīng)用受到限制，其最大的缺陷還是靈敏度僅為0.1 mg/L，實驗存在人為誤差。②近年來，國內(nèi)外學(xué)者提出分光比色法校準移液器，如重鉻酸鉀法、甲基橙法、曙紅法等[11、12]，由于此類方法采用“朗拜—比耳”定律，最適宜吸光度在0.05～0.65之間，而對高、低濃度溶液存在線性偏差，一般分光光度比色法的檢測靈敏度為10-3～10-4g/L。

銪原子標記具有高特異性、高靈敏度、低本底、重復(fù)性好、示蹤物穩(wěn)定、標準曲線線性范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、操作簡便、可以無數(shù)次重復(fù)檢測、無放射性污染等優(yōu)點。通過熒光度或相對熒光強度比值，來判斷反應(yīng)體系中被分析物的濃度，達到定量分析之目的，深受生物醫(yī)學(xué)研究工作者的青睞，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢驗和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究，成為最有發(fā)展前途的超微量分析技術(shù)，是當(dāng)前標記免疫分析發(fā)展到新階段的代表[13]。銪原子標記的發(fā)射光和激發(fā)光有較大的STOKES位移（200 nm），光譜間干擾小，同時，本底低（200～400cps）——特異性強；原子標記，位阻體積小，檢測靈敏度高達10-12～10-14g/L；熒光壽命長，半衰期長，穩(wěn)定性高；標準曲線線性范圍寬——可測容量范圍廣。

根據(jù)標準移液器與待檢移液器對同一放射性銪溶液各10次吸樣熒光強度值，計算出各移液器的均值、SD、CV%。從CV%值的大小反映移液器精密度——移液器的隨機誤差。通過待檢移液器與標準移液器的CPM均值比較，計算相對誤差(R%)，R%值大小反映被檢移液器的準確度——移液器的系統(tǒng)誤差。對CV%值超過規(guī)定者應(yīng)棄用；對CV%值穩(wěn)定、而相對R%值超出允許范圍的非標準移液器，可通過移液器專用扳手調(diào)節(jié)頂部旋鈕，最終達到對移液器的比對與校準目的。

總之，銪法進行移液器容量誤差的鑒別，其方法靈敏、精確、簡便與實用，可適用于臨床實驗室移液器的常規(guī)比對與校準。

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