李 晶， 趙曉宇， 張先成， 王玉霞張淑梅， 張?jiān)坪?孟利強(qiáng)

（1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010）

近年生物質(zhì)譜技術(shù)以其高效，快速及其自動(dòng)化的特點(diǎn)，在蛋白質(zhì)鑒定方面得到了廣泛的應(yīng)用。利用質(zhì)譜技術(shù)，可以更精確地測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，而且獲得的肽指紋圖譜可以為蛋白質(zhì)的性質(zhì)提供更加準(zhǔn)確的信息。

生防枯草芽孢桿菌可分泌多種特性不同的抗菌蛋白［1,2］?？莶菅挎邨U菌B29菌株是一株具有廣譜高效抗菌作用的生防細(xì)菌［3］，從該菌株發(fā)酵液中已分離純化出一種具有抗菌活性的蛋白B29I［4］，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析可進(jìn)一步揭示該蛋白的性質(zhì)，為以后的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

將純化后的抗菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，切下待測(cè)條帶，放入裝有無(wú)菌蒸餾水的1.5mL離心管中，交由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心進(jìn)行膠內(nèi)酶切、肽段測(cè)序，以及肽指紋圖譜的檢索。

1.1 膠內(nèi)酶解

將抗菌蛋白SDS-PAGE電泳條帶在膠內(nèi)進(jìn)行酶解，具體步驟如下：

（1）用100μL 100mM碳酸氫銨溶液/50%乙腈脫色20min，丟棄上清液。重復(fù)該操作直至凝膠變?yōu)榘咨?/p>

（2）加入60μL乙腈使凝膠脫水10min，丟棄上清液。將凝膠干燥后加入適量胰蛋白酶液。酶液用100mM碳酸氫銨溶液配制，濃度為12.5ng/μL。于4℃放置30min使凝膠完全泡脹；

（3）加約20μL 100mM碳酸氫銨溶液覆蓋，于37℃保溫12h，吸出上清液。凝膠用50μL0.1%甲酸/50%乙腈提取2次，每次15min。合并上清液及提取液后濃縮至約5μL以供質(zhì)譜分析。

1.2 質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析

酶解產(chǎn)物濃縮后用C18ZipTip（Millipore公司）脫鹽：先用0.1%TFA/50%乙腈潤(rùn)濕填料并用0.1%TFA平衡，再將樣品吸過(guò)ZipTip后用0.1%TFA反復(fù)沖洗，最后用10μL的0.1%TFA 33%乙腈洗脫。將2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）溶于 1:3的乙腈/水溶液，配制成100mg/mL的溶液。先將0.5μLDHB溶液點(diǎn)在不銹鋼MALDI樣品板上，再將0.5μL樣品溶液點(diǎn)在基質(zhì)上使其混合并在室溫下自然干燥。樣品用配有o-MALDI（orthogonal MALDI）離子源的QSTAR Pulsar質(zhì)譜儀檢測(cè)。

1.3 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

登陸mascot網(wǎng)站，直接調(diào)用MALDI-TOF-MS得到的肽指紋圖譜（.peaklist文件），進(jìn)行檢索。

2 結(jié)果與討論

將聚丙烯酰胺凝膠電泳后的抗菌蛋白B29I樣品帶在膠內(nèi)進(jìn)行酶切后，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)，得到肽質(zhì)量指紋圖（peptide mass fingerprinting,PMF），結(jié)果如圖1所示。

圖1 B29I酶切產(chǎn)物MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.1 MALDI-TOP MS of antifungal protein B29I

將抗菌蛋白B29I的肽質(zhì)量指紋圖在Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，未得到有意義的結(jié)果，初步判定B29I為一種未被報(bào)道過(guò)的蛋白。將酶切產(chǎn)物經(jīng)Q-TOF2檢測(cè)，得到Q-TOF2質(zhì)譜圖，結(jié)果如圖2所示。通過(guò)Q-TOF2檢測(cè)，在B29I酶切產(chǎn)物中選取3個(gè)雙電荷肽段，三個(gè)肽段質(zhì)荷比分別為623.33、728.85和781.93。將這三個(gè)肽段經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)碰撞碎裂（collision-induced dissociation，CID）成為更小的碎片離子，測(cè)量這些碎片離子的質(zhì)荷比和強(qiáng)度，獲得串聯(lián)質(zhì)譜。質(zhì)荷比為623.33的肽段序列為KTHVLEDEFK，相對(duì)分子質(zhì)量為1244.64；質(zhì)荷比為728.85的肽段序列為KGYQTGDFGAYLH，相對(duì)分子質(zhì)量為1455.68；質(zhì)荷比為781.93的肽段序列為RTYEVAEESPVLGL，相對(duì)分子質(zhì)量為1561.82。

圖2 B29I酶切產(chǎn)物Q-TOF2質(zhì)譜圖Fig.2 Q-TOF2 of antifungal protein B29I

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)生防枯草芽孢桿菌B29菌株分泌的抗菌蛋白B29I進(jìn)行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析，獲得了抗菌蛋白B29I的肽指紋圖譜，初步確定抗菌蛋白B29I為一種新蛋白。

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［2］謝棟,彭憬,王津紅,等.枯草芽孢桿菌抗菌蛋白X98Ⅲ的純化與性質(zhì)［J］.微生物學(xué)報(bào),1998,38(1):13～19.

［3］李晶,楊謙,張淑梅,等.枯草芽孢桿菌B29菌株防治黃瓜枯萎病的田間效果及安全性評(píng)價(jià)初報(bào)［J］.中國(guó)蔬菜,2009,2:30～33.

［4］LI JING,YANGQIAN,ZHAOLI-HUA,et al.Purification and charac terization ofa novel antifungal protein fromBacillus subtilis strain B29［J］.J.ZhejiangUniv.Sci.B.,2009,10(4):264～272.