徐 婷， 吳 多， 楊 雪， 付慧娟， 王金剛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

紫葉酢漿草（Oxalis triangularisA.St.-Hil.‘Purpurea’），又稱紫蝴蝶，是酢漿草科酢漿草屬多年生草本植物。因其葉片紫紅色、花淡雅清香、管理粗放、園林應(yīng)用廣泛而深受人們喜愛。為了滿足人們對花卉求新求異的需要，且紫葉酢漿草本身具有的諸多優(yōu)良特性，對紫葉酢漿草進(jìn)行轉(zhuǎn)基因分子育種，培育更多優(yōu)良的酢漿草品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前紫葉酢漿草的研究多集中于栽培管理和組織快繁等方面［1,2］，對于轉(zhuǎn)基因方面的研究還未見報道。本試驗(yàn)以紫葉酢漿草葉片為外植體，利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)法將查兒酮合成酶基因RNA干擾載體轉(zhuǎn)入紫葉酢漿草中。根據(jù)已報道的紫花苜蓿［3］、百合［4］、月季［5］、洋桔梗［6］、馬鈴薯［7］等植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究情況，對紫葉酢漿草遺傳轉(zhuǎn)化的主要影響因素卡那抗性、除菌劑種類及濃度和侵染時間等影響因素進(jìn)行研究，旨在建立紫葉酢漿草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，為其轉(zhuǎn)基因分子育種尋求一條快速有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

紫葉酢漿草無菌苗，農(nóng)桿菌EHA105、查爾酮合成酶RNA干擾表達(dá)載體均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林育種實(shí)驗(yàn)室保存。Taq酶、DL2000購于TaKaRa公司，卡那霉素、頭孢唑啉那、阿莫西林克拉維酸鉀等均為國產(chǎn)針劑，其它試劑均為分析純。M1培養(yǎng)基:MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L M2培養(yǎng)基:MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/Lkm30mg/L+Amo100mg/L

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 卡那霉素篩選壓力的確定

首先設(shè)定 0，25，50，75，100 mg/L 6 個梯度，結(jié)果表明除0mg/L外分化率均為0。此基礎(chǔ)上，將Km濃度重新設(shè)置為 0、5、10、15、20、25 、30mg/L 7 個梯度。具體過程：將紫葉酢漿草葉盤分別接種在含Km濃度為0、5、10、15、20、25 mg/L的 M1 分化培養(yǎng)基上，光下培養(yǎng)，每15d繼代一次，3周后統(tǒng)計分化結(jié)果。

1.2.2 除菌劑種類及濃度的確定

根據(jù)所查閱文獻(xiàn)，選用2種除菌劑，比較其除菌效果及其對紫葉酢漿草葉盤分化的影響。分別是頭孢唑啉那 0、100、200、300、400、500、600 mg/L 7 個梯度；阿莫西林克拉維酸鉀 0、25、50、75、100、125、150 mg/L 7個梯度。

并 在 此 實(shí) 驗(yàn) 基 礎(chǔ) 上 設(shè) 置 Amo0，75，100，125，150mg/L 5個梯度，將紫葉酢漿草葉盤接種于含有不同濃度AmoM1培養(yǎng)基上，篩選不抑制植物生長的最大除菌劑濃度。

1.2.3 農(nóng)桿菌最佳侵染時間的確定

采用OD600＝0.6～0.8的農(nóng)桿菌菌液侵染預(yù)培養(yǎng)3d的無菌苗葉片，設(shè)計的侵染時間分別為 2，5，7，10，15，20 min，侵染結(jié)束后，將其接種到M2培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一段時間后，觀察其外植體和農(nóng)桿菌的長勢并記錄結(jié)果。

1.2.4 農(nóng)桿菌對外植體的侵染

根據(jù)《植物基因工程》［8］根瘤農(nóng)桿菌葉盤法轉(zhuǎn)化，將查爾酮合成酶RNA干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到紫葉酢漿草。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測

用PBI-CHSi中的GUS-1和CHSF-A為的引物進(jìn)行PCR檢測。具體反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性7min；94℃變性 30s；65℃退火 30s；30 個循環(huán) ；72℃延伸1.5min；72℃延伸10min；4℃終止反應(yīng)。電泳分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素篩選壓力的確定

將 Km 濃 度 重 新 設(shè) 置 為 0、5、10、15、20、25 、30mg/L7個梯度。結(jié)果見表1和圖1。

表1 卡那霉素濃度梯度試驗(yàn)Table 1 The gradient experiment ofkanamycin concentration

圖1 卡那霉素篩選壓力的確定Fig.1The experiment of Km selection pressure

由表1和圖1可知，第一次接種Km濃度為25mg/L時紫葉酢漿草葉盤分化率為0，第二次接種Km濃度為25mg/L時紫葉酢漿草葉盤分化率為5.7%。說明具有個體差異性。因此為了提高篩選效果，減少因個體差異而出現(xiàn)的未轉(zhuǎn)化目的基因的抗性植株，將Km濃度確定為30mg/L。

2.2 除菌劑濃度的測定

含有CHS基因RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌加入到含有不同濃度除菌劑的YEP培養(yǎng)基中200r/min，28℃培養(yǎng)48h，用紫外分光光度計檢測濃度。結(jié)果見圖2。

圖2 除菌劑及濃度篩選Fig.2 Selection of degerming agent and concentration

當(dāng)Amo100～150mg/L能有效抑制農(nóng)桿菌的生長；當(dāng)Cef 300～500mg/L時能有效抑制農(nóng)桿菌的生長。同時設(shè)置 Amo0，75，100，125，150mg/L5 個梯度接種紫葉酢漿草葉盤，篩選不抑制植物生長的最大除菌劑濃度。結(jié)果見表2。

表2 除菌劑濃度梯度實(shí)驗(yàn)Table 2 The gradient experiment ofdegermingagent concentration

在Amo濃度為100mg/L時，外植體的分化率為71.67%與Amo濃度為76.67%時差距不大，而當(dāng)Amo濃度為125mg/L時，外植體分化率僅為60%。且當(dāng)Amo100～150mg/L均能有效抑制農(nóng)桿菌的生長，本著篩選不抑制植物生長的最大除菌劑濃度的原則，確定紫葉酢漿草轉(zhuǎn)化除菌劑濃度為Amo100mg/L。

2.3 農(nóng)桿菌最佳侵染時間的確定

實(shí)驗(yàn)證明不同的侵染時間對外植體的轉(zhuǎn)化有較大的影響。對不同侵染時間的外植體分化進(jìn)行了統(tǒng)計和觀察，結(jié)果見表3。

表3 農(nóng)桿菌侵染時間確定Table 3 The time ofinfection ofagrobacterium

從表3中可以看出，侵染時間為2 min時，轉(zhuǎn)化率稍低，植株長勢弱；侵染時間為15～20 min時，轉(zhuǎn)化幾乎不成功；且褐化率高，除菌困難；侵染時間5～10 min時分化率較高，褐化率低，除菌較容易，其中侵染時間為7 min時，植株長勢最好，確定侵染時間為7 min。

2.4 農(nóng)桿菌對外植體的侵染

經(jīng)試驗(yàn)確定農(nóng)桿菌對紫葉酢漿草侵染轉(zhuǎn)化的具體條件為：

預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS+NAA0.5 mg/L+6-BA1.5 mg/L；預(yù)培養(yǎng)時間為3 d；侵染時間為7 min；共培養(yǎng)時間為2～3d；篩選培養(yǎng)基:MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L+km30mg/L+Amo100mg/；25℃光照培養(yǎng)，15～20d 繼代一次。大約25～30d分化出不定芽，當(dāng)芽長至3cm時進(jìn)行生根培養(yǎng)，然后進(jìn)行馴化培養(yǎng)。圖3為轉(zhuǎn)基因植株再生過程。

圖3 紫葉酢漿草植株再生Fig.3 Plant regeneration of oxalis triangularis A.St.-Hil.‘Purpurea’

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

以轉(zhuǎn)pBI-CHSi質(zhì)?？剐灾仓甑目侱NA為模板，以質(zhì)粒pBI-CHSi為陽性對照，分別以未轉(zhuǎn)化植株的總DNA和水為陰性對照和負(fù)對照，以CHSi基因序列特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。陽性對照和部分轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出約509p的目的片段，而陰性對照無擴(kuò)增帶（見圖4）。用得到的23個轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測，結(jié)果表明其中有9株為陽性植株，陽性率為37.5%。

圖4 轉(zhuǎn)pBI-CHSi質(zhì)粒抗性植株的PCR檢測Fig.4 PCR analysis of regeneration plants

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室已有的研究基礎(chǔ)上，確定了紫葉酢漿草利用農(nóng)桿菌葉盤法轉(zhuǎn)化的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系：預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基 M1：MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L；預(yù)培養(yǎng)時間為3d；侵染時間為7min；共培養(yǎng)時間為2～3 d；篩選培養(yǎng)基:MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.5 mg/L km30 mg/L+Amo100 mg/L；卡納篩選濃度為30 mg/L,除菌劑為Amo100 mg/L，25℃光照培養(yǎng)。

在此條件下，觀察到轉(zhuǎn)基因植株生長勢較弱，生長緩慢，比正常植株生長要遲緩半個月左右。經(jīng)分析認(rèn)為由于轉(zhuǎn)入的是查兒酮合成酶RNAi，查兒酮合成酶基因是色素形成的關(guān)鍵基因，對其基因的干擾不僅在花色形成上產(chǎn)生影響，對其光合作用也可能產(chǎn)生影響，如果實(shí)驗(yàn)順利，我們對其功能的變化進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究紫葉酢漿草轉(zhuǎn)化率為31.67%，轉(zhuǎn)化率偏低，且有褐化現(xiàn)象。今后將對于農(nóng)桿菌侵染時間及如何提高紫葉酢漿草的轉(zhuǎn)化率，降低褐化進(jìn)行進(jìn)一步的探討及實(shí)驗(yàn)。

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