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        紫葉酢漿草遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化*

        2010-07-26 06:14:00付慧娟王金剛
        黑龍江科學(xué) 2010年2期
        關(guān)鍵詞:酢漿草紫葉外植體

        徐 婷, 吳 多, 楊 雪, 付慧娟, 王金剛

        (東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)

        紫葉酢漿草(Oxalis triangularisA.St.-Hil.‘Purpurea’),又稱紫蝴蝶,是酢漿草科酢漿草屬多年生草本植物。因其葉片紫紅色、花淡雅清香、管理粗放、園林應(yīng)用廣泛而深受人們喜愛。為了滿足人們對花卉求新求異的需要,且紫葉酢漿草本身具有的諸多優(yōu)良特性,對紫葉酢漿草進(jìn)行轉(zhuǎn)基因分子育種,培育更多優(yōu)良的酢漿草品種具有重要的現(xiàn)實意義。

        目前紫葉酢漿草的研究多集中于栽培管理和組織快繁等方面[1,2],對于轉(zhuǎn)基因方面的研究還未見報道。本試驗以紫葉酢漿草葉片為外植體,利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)法將查兒酮合成酶基因RNA干擾載體轉(zhuǎn)入紫葉酢漿草中。根據(jù)已報道的紫花苜蓿[3]、百合[4]、月季[5]、洋桔梗[6]、馬鈴薯[7]等植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究情況,對紫葉酢漿草遺傳轉(zhuǎn)化的主要影響因素卡那抗性、除菌劑種類及濃度和侵染時間等影響因素進(jìn)行研究,旨在建立紫葉酢漿草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系,為其轉(zhuǎn)基因分子育種尋求一條快速有效的途徑。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        紫葉酢漿草無菌苗,農(nóng)桿菌EHA105、查爾酮合成酶RNA干擾表達(dá)載體均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林育種實驗室保存。Taq酶、DL2000購于TaKaRa公司,卡那霉素、頭孢唑啉那、阿莫西林克拉維酸鉀等均為國產(chǎn)針劑,其它試劑均為分析純。M1培養(yǎng)基:MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L M2培養(yǎng)基:MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/Lkm30mg/L+Amo100mg/L

        1.2 實驗方法

        1.2.1 卡那霉素篩選壓力的確定

        首先設(shè)定 0,25,50,75,100 mg/L 6 個梯度,結(jié)果表明除0mg/L外分化率均為0。此基礎(chǔ)上,將Km濃度重新設(shè)置為 0、5、10、15、20、25 、30mg/L 7 個梯度。具體過程:將紫葉酢漿草葉盤分別接種在含Km濃度為0、5、10、15、20、25 mg/L的 M1 分化培養(yǎng)基上,光下培養(yǎng),每15d繼代一次,3周后統(tǒng)計分化結(jié)果。

        1.2.2 除菌劑種類及濃度的確定

        根據(jù)所查閱文獻(xiàn),選用2種除菌劑,比較其除菌效果及其對紫葉酢漿草葉盤分化的影響。分別是頭孢唑啉那 0、100、200、300、400、500、600 mg/L 7 個梯度;阿莫西林克拉維酸鉀 0、25、50、75、100、125、150 mg/L 7個梯度。

        并 在 此 實 驗 基 礎(chǔ) 上 設(shè) 置 Amo0,75,100,125,150mg/L 5個梯度,將紫葉酢漿草葉盤接種于含有不同濃度AmoM1培養(yǎng)基上,篩選不抑制植物生長的最大除菌劑濃度。

        1.2.3 農(nóng)桿菌最佳侵染時間的確定

        采用OD600=0.6~0.8的農(nóng)桿菌菌液侵染預(yù)培養(yǎng)3d的無菌苗葉片,設(shè)計的侵染時間分別為 2,5,7,10,15,20 min,侵染結(jié)束后,將其接種到M2培養(yǎng)基上,培養(yǎng)一段時間后,觀察其外植體和農(nóng)桿菌的長勢并記錄結(jié)果。

        1.2.4 農(nóng)桿菌對外植體的侵染

        根據(jù)《植物基因工程》[8]根瘤農(nóng)桿菌葉盤法轉(zhuǎn)化,將查爾酮合成酶RNA干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到紫葉酢漿草。

        1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測

        用PBI-CHSi中的GUS-1和CHSF-A為的引物進(jìn)行PCR檢測。具體反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性7min;94℃變性 30s;65℃退火 30s;30 個循環(huán) ;72℃延伸1.5min;72℃延伸10min;4℃終止反應(yīng)。電泳分析結(jié)果。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 卡那霉素篩選壓力的確定

        將 Km 濃 度 重 新 設(shè) 置 為 0、5、10、15、20、25 、30mg/L7個梯度。結(jié)果見表1和圖1。

        表1 卡那霉素濃度梯度試驗Table 1 The gradient experiment ofkanamycin concentration

        圖1 卡那霉素篩選壓力的確定Fig.1The experiment of Km selection pressure

        由表1和圖1可知,第一次接種Km濃度為25mg/L時紫葉酢漿草葉盤分化率為0,第二次接種Km濃度為25mg/L時紫葉酢漿草葉盤分化率為5.7%。說明具有個體差異性。因此為了提高篩選效果,減少因個體差異而出現(xiàn)的未轉(zhuǎn)化目的基因的抗性植株,將Km濃度確定為30mg/L。

        2.2 除菌劑濃度的測定

        含有CHS基因RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌加入到含有不同濃度除菌劑的YEP培養(yǎng)基中200r/min,28℃培養(yǎng)48h,用紫外分光光度計檢測濃度。結(jié)果見圖2。

        圖2 除菌劑及濃度篩選Fig.2 Selection of degerming agent and concentration

        當(dāng)Amo100~150mg/L能有效抑制農(nóng)桿菌的生長;當(dāng)Cef 300~500mg/L時能有效抑制農(nóng)桿菌的生長。同時設(shè)置 Amo0,75,100,125,150mg/L5 個梯度接種紫葉酢漿草葉盤,篩選不抑制植物生長的最大除菌劑濃度。結(jié)果見表2。

        表2 除菌劑濃度梯度實驗Table 2 The gradient experiment ofdegermingagent concentration

        在Amo濃度為100mg/L時,外植體的分化率為71.67%與Amo濃度為76.67%時差距不大,而當(dāng)Amo濃度為125mg/L時,外植體分化率僅為60%。且當(dāng)Amo100~150mg/L均能有效抑制農(nóng)桿菌的生長,本著篩選不抑制植物生長的最大除菌劑濃度的原則,確定紫葉酢漿草轉(zhuǎn)化除菌劑濃度為Amo100mg/L。

        2.3 農(nóng)桿菌最佳侵染時間的確定

        實驗證明不同的侵染時間對外植體的轉(zhuǎn)化有較大的影響。對不同侵染時間的外植體分化進(jìn)行了統(tǒng)計和觀察,結(jié)果見表3。

        表3 農(nóng)桿菌侵染時間確定Table 3 The time ofinfection ofagrobacterium

        從表3中可以看出,侵染時間為2 min時,轉(zhuǎn)化率稍低,植株長勢弱;侵染時間為15~20 min時,轉(zhuǎn)化幾乎不成功;且褐化率高,除菌困難;侵染時間5~10 min時分化率較高,褐化率低,除菌較容易,其中侵染時間為7 min時,植株長勢最好,確定侵染時間為7 min。

        2.4 農(nóng)桿菌對外植體的侵染

        經(jīng)試驗確定農(nóng)桿菌對紫葉酢漿草侵染轉(zhuǎn)化的具體條件為:

        預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS+NAA0.5 mg/L+6-BA1.5 mg/L;預(yù)培養(yǎng)時間為3 d;侵染時間為7 min;共培養(yǎng)時間為2~3d;篩選培養(yǎng)基:MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L+km30mg/L+Amo100mg/;25℃光照培養(yǎng),15~20d 繼代一次。大約25~30d分化出不定芽,當(dāng)芽長至3cm時進(jìn)行生根培養(yǎng),然后進(jìn)行馴化培養(yǎng)。圖3為轉(zhuǎn)基因植株再生過程。

        圖3 紫葉酢漿草植株再生Fig.3 Plant regeneration of oxalis triangularis A.St.-Hil.‘Purpurea’

        2.5 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測

        以轉(zhuǎn)pBI-CHSi質(zhì)??剐灾仓甑目侱NA為模板,以質(zhì)粒pBI-CHSi為陽性對照,分別以未轉(zhuǎn)化植株的總DNA和水為陰性對照和負(fù)對照,以CHSi基因序列特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。陽性對照和部分轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增出約509p的目的片段,而陰性對照無擴(kuò)增帶(見圖4)。用得到的23個轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測,結(jié)果表明其中有9株為陽性植株,陽性率為37.5%。

        圖4 轉(zhuǎn)pBI-CHSi質(zhì)??剐灾仓甑腜CR檢測Fig.4 PCR analysis of regeneration plants

        3 結(jié) 論

        本實驗在實驗室已有的研究基礎(chǔ)上,確定了紫葉酢漿草利用農(nóng)桿菌葉盤法轉(zhuǎn)化的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系:預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基 M1:MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L;預(yù)培養(yǎng)時間為3d;侵染時間為7min;共培養(yǎng)時間為2~3 d;篩選培養(yǎng)基:MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.5 mg/L km30 mg/L+Amo100 mg/L;卡納篩選濃度為30 mg/L,除菌劑為Amo100 mg/L,25℃光照培養(yǎng)。

        在此條件下,觀察到轉(zhuǎn)基因植株生長勢較弱,生長緩慢,比正常植株生長要遲緩半個月左右。經(jīng)分析認(rèn)為由于轉(zhuǎn)入的是查兒酮合成酶RNAi,查兒酮合成酶基因是色素形成的關(guān)鍵基因,對其基因的干擾不僅在花色形成上產(chǎn)生影響,對其光合作用也可能產(chǎn)生影響,如果實驗順利,我們對其功能的變化進(jìn)行進(jìn)一步研究。本研究紫葉酢漿草轉(zhuǎn)化率為31.67%,轉(zhuǎn)化率偏低,且有褐化現(xiàn)象。今后將對于農(nóng)桿菌侵染時間及如何提高紫葉酢漿草的轉(zhuǎn)化率,降低褐化進(jìn)行進(jìn)一步的探討及實驗。

        [1]付慧娟,徐婷.紫葉酢漿草體細(xì)胞無性系建立的研究[A].中國觀賞園藝研究進(jìn)展[C].北京:中國林業(yè)出版,2008:241-244.

        [2]胡國富,李鳳蘭,胡寶忠,等.三角紫葉酢漿草的組織培養(yǎng)[J],北方園藝,2008(6):176-178.

        [3]曲靜,王丕,楊金慧.農(nóng)桿菌介導(dǎo)紫花苜蓿子葉遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素研究[J],安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(22):10421-10423.

        [4]王凱,車代弟,王金剛,等.百合遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,39(5):39-43.

        [5]高莉萍,包滿珠.優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的月季遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,27(4):60-64.

        [6]鄭陽霞,黃彬城.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋桔梗遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].核農(nóng)學(xué)報,2009,23(4):597-60.

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