福建師范大學生命科學學院 柯 軼 巫文政 毛 寧

冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)是球殼目(Sphaeriales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)的蟲生真菌[1]。自古以來冬蟲夏草就為廣大人們所熟知的具有保健作用的食用菌。冬蟲夏草主要含有核苷類化合物、氨基酸、多糖類、甘露醇等成分，多糖是冬蟲夏草所含的有效生理活性物質中最重要最豐富的種群之一，具有抗腫瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗輻射、降血糖、降血脂等生物學活性[2]。多糖是當今新藥開發(fā)的重要方向之一，是冬蟲夏草開發(fā)研究的一個重要突破口。

天然蟲草自然寄生率低，生長條件苛刻，加上人們的濫采，導致天然資源緊缺。天然蟲草已遠遠不能滿足日益增長的市場需求，而且天然蟲草目前市場價格昂貴，已高達每公斤3～4萬元。研究表明采用人工液體發(fā)酵的蟲草菌絲的有效成分含量與天然蟲草幾乎相當[3]，并且液體發(fā)酵法能在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量的菌絲體，因此人工發(fā)酵蟲草將是生產(chǎn)蟲草產(chǎn)品的重要手段，具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

蟲草真菌Fc-001 （Cordyceps fungi Fc-001），福建師范大學菌保藏中心保藏

1.1.2 試劑

玉米粉，玉米淀粉，早米粉，白糖，葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，奶粉，黃豆粉，花生粉，酵母膏，玉米漿，牛肉膏，均為市售。

MgSO4·7H2O，KH2PO4，三氯甲烷，正丁醇，乙醇，苯酚，硫酸，均為分析純。

1.1.3 主要儀器

DELTA 320PH計，SHK-99-Ⅱ型臺式恒溫搖床，SONICS超聲波破碎儀，HH-4型恒溫水浴鍋，日立CR21G高速離心機，721分光光度計。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:PDA

種子培養(yǎng)基（%）: 葡萄糖2，酵母粉1，酵母膏0.5，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，115℃，滅菌30min。

發(fā)酵基礎培養(yǎng)基（%）:玉米淀粉4，酵母粉2，酵母膏0.5，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，115℃，滅菌30min。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子液培養(yǎng):將活化的斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中，24℃、180r/min振蕩培養(yǎng)3d。

發(fā)酵培養(yǎng):將培養(yǎng)好的液體種子按5%(V／V)的移種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，24℃，180r/min振蕩培養(yǎng)7d。每個因素做兩個重復。

1.2.2 多糖提取

發(fā)酵產(chǎn)物通過過濾分離菌絲體并用蒸餾水洗3遍，將菌絲體干燥至恒重。干菌絲研磨，過200目篩后稱取0.4g菌絲體粉末溶于50mL蒸餾水中，置超聲波破碎8min，90℃水浴2h后定容至50mL，并離心得到上清液，用sevag法除蛋白[4]，將pH調(diào)至7.0，吸取10mL置于4℃醇析12h[5]，離心得到多糖沉淀并用40mL蒸餾水復溶。

1.2.3 多糖測定

1.2.3.1 測定方法

采用苯酚-硫酸法測定[6-7]。

1.2.3.2 測定標準曲線

配制50 μg/mL葡萄糖標準溶液。分別吸取葡萄糖標準溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL用蒸餾水補充至2.0mL，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，混勻，立即滴加濃硫酸5mL，搖勻，60℃水浴15 min，然后置冷水中冷卻15min，在490nm波長處比色。

1.2.3.3 樣品多糖測定

取樣品溶液0.2 mL用蒸餾水補充至2.0mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，立即滴加濃硫酸5mL，搖勻，60℃水浴15min，然后置冷水中冷卻15min，在490nm波長處比色。

2 結果與分析

2.1 標準曲線回歸方程建立

用紫外分光光度計，在490nm的波長處比色，以試劑空白做參比，實驗結果見圖 1。

所得其線性回歸方程式y(tǒng) = 0.0068x + 0.0002，相關系數(shù)R=0.9998。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 不同碳源對多糖產(chǎn)量的影響

以4%的玉米粉、玉米淀粉、早米粉、白糖、葡萄糖為碳源的發(fā)酵基礎培養(yǎng)基（去除玉米淀粉）培養(yǎng)蟲草菌絲體，24℃，180r/min振蕩培養(yǎng)7d，研究其對蟲草產(chǎn)胞內(nèi)多糖的影響。結果見表1。由表1可以看出，以上述成分作為碳源的時候，對生物量的影響排序依次是:玉米粉＞早米粉＞玉米淀粉＞白糖＞葡萄糖，對蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響排序依次是:玉米淀粉＞玉米粉＞早米粉＞白糖＞葡萄糖。綜合考慮生物量，胞內(nèi)多糖含量等因素，最終決定以玉米淀粉作為碳源。

表1 不同碳源對冬蟲夏草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

2.3 不同氮源對多糖產(chǎn)量的影響

以 2%的酵母粉、蛋白胨、奶粉、黃豆粉、花生粉為氮源的發(fā)酵基礎培養(yǎng)基（去除酵母粉）培養(yǎng)蟲草菌絲體，24℃，180r/min振蕩培養(yǎng)7d，研究其對冬蟲夏草產(chǎn)胞內(nèi)多糖的影響。結果見表2。由表2可以看出，以上述成分作為氮源時，花生粉作為氮源所獲得蟲草菌絲產(chǎn)量最高，酵母粉次之；酵母粉作為氮源發(fā)酵的菌絲中胞內(nèi)多糖含量明顯高于其他氮源。胞內(nèi)多糖總量依次為:酵母粉＞黃豆粉＞奶粉＞花生粉＞蛋白胨。綜合生物量及蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量因素，選擇酵母粉為最佳氮源。

表2 不同氮源對冬蟲夏草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

2.4 不同生物素對多糖產(chǎn)量的影響

發(fā)酵基礎培養(yǎng)基（去除酵母膏）分別由0.5%的酵母膏、玉米漿、牛肉膏作為生物素提供生長因子，不加生物素為空白對照，24℃，180r/min振蕩培養(yǎng)7d，研究其對冬蟲夏草胞內(nèi)多糖的影響。結果見表3。由表3可以看出，酵母膏、玉米漿、牛肉膏都對蟲草菌絲體生長有促進作用，但以玉米漿、牛肉膏為生長因子時，蟲草菌絲胞內(nèi)多糖總量都少于空白對照，只有酵母膏對蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量有促進作用。故選用酵母膏為最適生物素。

表3 不同生物素對冬蟲夏草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

2.5 不同pH對多糖產(chǎn)量的影響

將基礎發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH值調(diào)節(jié)至5、6、7、8，24℃，180r/min振蕩培養(yǎng)7d。結果見表4。由表4可以看出，起始pH 5.0的條件下獲得蟲草菌絲產(chǎn)量最高，但其胞內(nèi)多糖含量較低。蟲草菌絲體的量隨起始pH的增大而降低，單位質量的菌絲中胞內(nèi)多糖含量隨起始pH的增大而增大。綜合生物量及蟲草胞內(nèi)多糖含量考慮，起始pH 7.0條件下能獲得較多的菌絲和最多的胞內(nèi)多糖。

表4 不同的起始pH值對冬蟲夏草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

2.6 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，以玉米淀粉，酵母粉，酵母膏，pH 進行四因子三水平正交優(yōu)化。正交試驗因素水平及結果見表5和表6，方差分析見表7[8-9]。

表5 正交試驗因素和水平表

表6 正交試驗結果直觀分析表

表7 方差分析表

正交試驗結果表明，影響蟲草產(chǎn)胞內(nèi)多糖的因素依次為玉米淀粉，酵母粉，pH，酵母膏。方差分析結果表明，玉米淀粉和酵母粉對蟲草產(chǎn)多糖有極顯著作用，而酵母膏水平的改變和pH的改變無顯著作用，對多糖的產(chǎn)量影響不顯著。因此培養(yǎng)基中只需添加酵母膏0.1%，pH可以選擇在6.5～7.5之間。最終確定蟲草產(chǎn)胞內(nèi)多糖最適培養(yǎng)基為:玉米淀粉5%，酵母粉2%，酵母膏0.1%，KH2PO30.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0。

3 結論與討論

蟲草多糖是蟲草的主要活性物質之一，它具有能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)作用，抗氧化，抗衰老，抗腫瘤，抗炎等多種活性作用，是當今醫(yī)藥研究新的重點方向之一。但蟲草具有生長周期長，栽培困難等問題，因此，通過對其無性菌絲體進行液體發(fā)酵從而獲得活性產(chǎn)物，可以比較容易地獲得所需活性物質，且縮短其生長周期，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

在液體發(fā)酵培養(yǎng)中，根據(jù)所需的產(chǎn)物的不同，如:菌體，胞內(nèi)多糖，胞外多糖等等，培養(yǎng)基的配方也不大相同。本實驗先對蟲草產(chǎn)胞內(nèi)多糖液體培養(yǎng)基條件進行單因素的篩選，試驗結果表明，玉米淀粉為最佳碳源，酵母粉為最佳氮源，酵母膏為最佳生物素，最適的pH為7.0，然后對其進行正交試驗，進一步確定蟲草產(chǎn)胞內(nèi)多糖最適配培養(yǎng)基為:玉米淀粉5%，酵母粉2%，酵母膏0.1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0。

同時，實驗結果也表明，最適合蟲草菌絲體生長的碳源是玉米粉，氮源是花生粉，生物素源是酵母膏，pH為5.0。因此，尋求一種既能提高蟲草菌絲體，同時又能增高蟲草胞內(nèi)多糖含量的培養(yǎng)基配方，成為進一步研究的方向。

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