董明姣， 張雯艷， 黃金蘭， 鐘振國， 李學堅*， 劉布鳴， 陳明生

(1.廣西中醫(yī)學院，廣西 南寧530001;2.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧530022)

芳竭丸是廣西中醫(yī)學院新藥開發(fā)中心在瑤藥驗方的基礎(chǔ)上研制的中藥復(fù)方制劑，由扶芳藤、天花粉、黃芪、龍血竭4味組成，具有益氣養(yǎng)陰，活血化瘀功效，用于糖尿病引起的周圍血管病變和周圍神經(jīng)病變，屬氣陰兩虛，瘀血阻絡(luò)癥，癥見咽干口渴，氣短乏力，眩暈心悸，舌胖質(zhì)暗，脈細，或見視物模糊，肢體麻痛，胸悶胸痛的治療［1］。為有效控制制劑質(zhì)量，作者采用TLC法對丸中的扶芳藤、天花粉和龍血竭進行了定性鑒別，采用HPLC法對丸中的龍血素B進行含量測定。結(jié)果報道如下。

1 儀器與試藥

威瑪龍LC-9000高效液相色譜儀(包括威瑪龍色譜工作站)，南寧市威瑪龍色譜科技有限公司。扶芳藤對照藥材(批號 121108-200001)，龍血竭對照藥材(批號 121252-200502)，天花粉對照藥材(批號121361-200401)，龍血素B對照品(批號111558-200405，供含量測定用)，龍血素C對照品(批號111559-200302，供鑒別用)，瓜氨酸對照品(批號110875-200506，供鑒別用)，均為中國藥品生物制品檢定所提供。芳竭丸樣品(批號 20071210，20080116，20080505)，廣西中醫(yī)學院新藥開發(fā)中心自制。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 扶芳藤的鑒別

取芳竭丸5 g，研細，加水20 mL，超聲處理1 h，濾過，濾液用氯仿振搖萃取2次，每次20 mL，棄氯仿液，再用乙酸乙酯振搖萃取2次，每次20 mL，收集乙酸乙酯萃取液，蒸干，殘渣用乙酸乙酯1 mL溶解，作為供試品溶液。另取扶芳藤對照藥材粉末10 g，加水煮1 h，放冷，濾過，濾液濃縮至10 mL，加乙醇20 mL，攪勻，沉淀，放置2 h。濾過，蒸去乙醇至無醇味，用氯仿振搖萃取2次，每次20 mL，棄氯仿層，再加乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，收集乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣用1 mL乙酸乙酯溶解，作為對照藥材溶液。取缺扶芳藤的陰性制劑，同法制得陰性對照溶液。照《中國藥典》薄層色譜法試驗［2］，吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照溶液各20 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20∶10∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置碘蒸汽中10 min，置254 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置下，顯相同的斑點，陰性無干擾，見圖1。

圖1 芳竭丸中扶芳藤的熒光薄層色譜圖

2.2 天花粉的鑒別

取芳竭丸3 g，研細，加水10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至5 mL，為供試品溶液。另取天花粉對照藥材1 g，研細，加5 mL水，超聲處理30 min，取上清液作為對照藥材溶液。再取瓜氨酸對照品，加水制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺天花粉的陰性制劑，同法制得陰性對照溶液。照《中國藥典》薄層色譜法試驗［2］，吸取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照溶液各5 μL，對照品溶液2 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-無水乙醇-冰醋酸-水(8∶2∶2∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴茚三酮乙醇試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置下，均顯相同顏色斑點，陰性無干擾，見圖2。

圖2 芳竭丸中天花粉的薄層色譜圖

2.3 龍血竭的鑒別

取芳竭丸15 g，研細，加氯仿50 mL，水浴回流1.5 h，取出，放冷，濾過，濾液濃縮至約1 mL，加硅膠2 g，拌勻，至干，移入硅膠柱(內(nèi)徑10 mm，100～120目硅膠3 g，干法裝柱)中。用石油醚(60～90℃)-氯仿(5∶1)混合溶液30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加氯仿0.5 mL溶解，作為供試品溶液。另取龍血竭對照藥材粉末5 g，同法制成對照藥材溶液。再取龍血素C對照品，加氯仿制成1 mL含2 mg的溶液，作為對照品溶液。取缺龍血竭的陰性制劑，同法制得陰性對照溶液。照《中國藥典》薄層色譜法試驗［2］，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各20 μL，對照品溶液、陰性對照溶液各10 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠HF254薄層板上，以石油醚(60～90℃)-氯仿(20∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置254 nm紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置下，均顯相同的熒光斑點，陰性無干擾。

3 龍血素 B 含量測定［3，4］

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(Kromasil C185 μm，4.6 mm×250 mm);流動相:乙腈為流動相A，1%冰醋酸溶液為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫;檢測波長:271 nm;進樣量:10 μL;理論塔板數(shù)按龍血素B峰計算應(yīng)不低于5000。色譜圖見圖3～6。

表1 色譜梯度表

圖3 龍血素B對照品HPLC圖

圖4 龍血竭對照藥材HPLC圖

3.1 樣品制備

供試品溶液的制備:取芳竭丸研細，稱取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氯仿30 mL，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)40 min，濾過，用pH=3的冰醋酸溶液萃取3次，每次10 mL，取氯仿層，揮干，加甲醇使溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取龍血素B對照品適量，精密稱定，加甲醇制成60 μg/mL的對照品溶液。取龍血竭粉末0.16 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液。按制劑處方比例和方法，制備缺龍血竭的陰性制劑，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照樣品溶液。陰性應(yīng)無干擾，見圖3～圖6。

圖5 芳竭丸供試品HPLC圖

圖6 陰性對照HPLC圖

3.2 標準曲線的制備

精密稱取龍血素B對照品10.2 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成102 μg/mL的對照品溶液。精密量取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 溶液，分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL，按上述色譜條件注入HPLC儀，測定峰面積值;以龍血素B進樣量(μg)為橫坐標，以峰面積值為縱坐標，繪制標準曲線，并求得標準曲線回歸方程為:峰面積Y=2803585X+103515，r=0.9994。結(jié)果表明龍血素 B 在0.204 ～1.224 μg范圍呈良好線性關(guān)系。

3.3 精密度試驗

分別取同一供試品和對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定龍血素B峰面積，計算RSD分別為0.33%和0.24%。

3.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，每隔2 h進樣一次，進行了12 h考察，測定龍血素B峰面積，計算RSD為1.21%。

3.5 重復(fù)性試驗

取同一批芳竭丸樣品，研細，分別取6份，每份重約0.5 g，精密稱定，按“供試品溶液的制備”方法進行提取、測定龍血素B峰面積，計算龍血素B的含量，得RSD為1.35%。

3.6 加樣回收率試驗

取已測知含量的芳竭丸樣品(平均含量為1.236 mg/g)9份，各0.25 g，精密稱定，編號1～9號，精密加入對照品溶液(龍血素B濃度為102μg/mL)，1～3號2 mL，4～6號3 mL，7～9號4 mL，分別加入氯仿:1～3號28 mL;4～6號27 mL;7～9號26 mL。按“供試品溶液的制備”方法進行提取，測定，計算。結(jié)果平均回收率為99.44%，RSD為1.85%(n=9)。

3.7 樣品測定

取3批芳竭丸樣品，按上述方法依法制備、測定龍血素B，采用外標法計算龍血素B的含量，結(jié)果見表2。

表2 3批樣品中龍血素B的測定結(jié)果(n=2)

4 討論

參照文獻［5］報道龍血素B紫外最大吸收波長為271 nm，因此選定HPLC檢測波長為271 nm。由于芳竭丸化學成分復(fù)雜，預(yù)試結(jié)果表明HPLC采用等度洗脫的分離效果不理想，故采用梯度洗脫。按龍血素B峰計算理論塔板數(shù)不低于5000時，龍血素B與其它雜質(zhì)峰達到基線分離，分離度大于1.5，可滿足定量要求;按此條件選三根不同的色譜柱(Hypersil C185 μm，4.6 mm ×250 mm;Diamonsil C185 μm，4.6 mm ×250 mm;Kromasil C185 μm，4.6 mm × 250 mm)分別測定理論塔板數(shù)，結(jié)果表明Kromasil C18色譜柱的分離效果較好。

龍血素B為黃酮類化合物，易溶于甲醇、乙醇、氯仿或稀堿液，供試品溶液的制備，考察了氯仿、甲醇、乙醇等不同溶劑，以及超聲或回流處理，結(jié)果表明，采用氯仿超聲處理較為理想。

本研究制訂的質(zhì)量控制方法簡便、專屬性強、準確度高、重現(xiàn)性、回收率高，可有效控制芳竭丸的產(chǎn)品質(zhì)量。

［1］李學堅，董明姣，蘇毅強，等.一種治療糖尿病并發(fā)癥的藥物組合及其制備方法:中國，ZL200610146636.2［P］.2007-05-23.

［2］中國藥典［S］.一部.2005.

［3］王 凌，徐玲玲，李 斌，等.生肌化瘀膏質(zhì)量標準研究［J］.中成藥，2006，(12):1742.

［4］高秀麗，蔣 蒨，王鵬嬌，等.龍血竭高效液相色譜特征研究［J］.中國中藥雜志，2007，(19):2026.

［5］劉布鳴，盧文杰，林 霄，等.龍血素B化學對照品研究［J］.廣西科學，2006，13(2):133.