亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        HPLC-CL聯(lián)用在線(xiàn)檢測(cè)消癌平注射液清除H2O2及O·-2自由基活性

        2010-07-25 10:27:12朱丹妮余伯陽(yáng)
        中成藥 2010年8期
        關(guān)鍵詞:魯米諾消癌化學(xué)發(fā)光

        朱 卉, 朱丹妮, 余伯陽(yáng)

        (中國(guó)藥科大學(xué)中藥復(fù)方教研室,江蘇南京211198)

        消癌平注射液是由蘿藦科(Asclepiadaceae)牛奶菜屬植物通關(guān)藤(Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn.)的干燥藤莖經(jīng)現(xiàn)代化工藝水提醇沉后制成,臨床用于治療原發(fā)性肝癌、食管癌和胃癌等惡性腫瘤,效果顯著[1]。腫瘤的發(fā)生與多種因素有關(guān),自由基是其中重要的因素,自由基參與人體的癌變過(guò)程。氧自由基所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷刺激腫瘤的發(fā)生[2]。研究還發(fā)現(xiàn)許多腫瘤病人的癌細(xì)胞中氧自由基清除系統(tǒng)存在障礙[3]。消癌平注射液在臨床上治療多種腫瘤獲得良好的療效,但其抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制目前仍不明確。

        化學(xué)發(fā)光分析法(CL)具有靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),與高效液相色譜(HPLC)的高效分離特性相結(jié)合,成為一種有效的痕量分析技術(shù)。近年來(lái),高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光(HPLC-CL)聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅速,已用于黃酮、合成除蟲(chóng)菊脂、多酚、兒茶酚胺、芳香族化合物等的檢測(cè)[4-8],還有文獻(xiàn)報(bào)道用于檢測(cè)藥物在體內(nèi)的分布、代謝情況[9-10]。

        本試驗(yàn)將HPLC-CL聯(lián)用技術(shù)用于消癌平注射液,在線(xiàn)檢測(cè)其酚酸類(lèi)物質(zhì)清除兩種氧自由基的活性,并利用HPLC-MS/MS分析技術(shù)鑒別其清除氧自由基的活性成分,為研究其抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理提供理論依據(jù)。

        1 材料

        1.1 儀器

        Agilent 1100型HPLC色譜儀(包括HP工作站、G1312A型二元泵、G1313A型全自動(dòng)微量進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G1314A型檢測(cè)器);Agilent 1100 LC/MSD Trap XCT ESI質(zhì)譜儀(Agilent Technologies,MA,USA)。

        BPCL-1-G-C微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x及 BPCL Appl.7.2數(shù)據(jù)處理工作站(中國(guó)科學(xué)院北京生物物理研究所);十萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司,上海,AE-240);PHS-25型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠(chǎng));BT-200恒流泵(滬西分析儀器廠(chǎng),上海)。

        1.2 試藥

        消癌平注射液(批號(hào)200903021,南京圣和藥業(yè)提供),綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110753-200413)。

        碳酸氫鈉和無(wú)水碳酸鈉(南京化學(xué)試劑廠(chǎng),AR),乙二胺四乙酸(EDTA)(上?;瘜W(xué)試劑總廠(chǎng),標(biāo)準(zhǔn)純),3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾,luminol)(Fluka公司)。過(guò)氧化氫(30%)(南京化學(xué)試劑廠(chǎng),AR),連苯三酚(遵義第二化學(xué)廠(chǎng),AR),乙腈(美國(guó)TEDIA公司,色譜級(jí)),磷酸(南京化學(xué)試劑廠(chǎng),AR)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 供試品溶液的制備

        消癌平注射液,取適量過(guò)0.45 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。

        2.2 色譜條件

        色譜柱:Diamonsil C18分析柱(250 mm ×4.6 mm I.D.5 μm)(Dikma Technologies)。流動(dòng)相:0.1%磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脫:0~15 min(B為2%~4%),15~20 min(B 為4% ~7%),20~35 min(B為7% ~10%),35~35.01(B 為10% ~11%),35.01~50 min(B 為11% ~11%),50~75 min(B為11% ~18%),75~100 min(B 為18% ~25%),100~105 min(B為25% ~2%)。流速1 mL/min,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm。進(jìn)樣量:5 μL。

        2.3 HPLC-MS/MS條件

        HPLC分析條件:0.1%磷酸改用0.2%甲酸,其它條件同2.2項(xiàng)。

        質(zhì)譜分析條件:負(fù)離子檢測(cè)模式;ESI離子源;掃描范圍:m/z 100-1200。毛細(xì)管電壓3500 V,干燥氣流速9.0 L/min,溫度350℃;霧化氣壓力40 psi。數(shù)據(jù)工作站為 LC/MSD Trap Software 4.2 and Data Analysis 2.2。

        2.4 化學(xué)發(fā)光溶液的制備

        碳酸緩沖液(pH 10.0 和11.0)0.1 mol/L 碳酸鈉水溶液和0.1 mol/L碳酸氫鈉水溶液按一定比例配成pH值為10.0和11.0緩沖液,分別加入 EDTA,使其濃度為6.3 ×10-3mol/L。

        魯米諾貯備液 精密稱(chēng)取一定量的魯米諾,用0.1 mmol/L的碳酸鈉水溶液配制成濃度為0.018 mol/L的魯米諾貯備液,避光,4℃保存,3天后使用。

        連苯三酚貯備液精密稱(chēng)取一定量的連苯三酚,用1mmol/L的鹽酸水溶液配制成濃度為0.01 mol/L的連苯三酚貯備液,避光,4℃保存。

        清除過(guò)氧化氫溶液的制備 試劑Ⅰ(魯米諾溶液):精密量取魯米諾貯備液用碳酸緩沖液(pH 10.0)稀釋至濃度為 9.0 ×10-6mol/L。試劑Ⅱ(過(guò)氧化氫溶液):30%的過(guò)氧化氫溶液加水稀釋至濃度為8.8 ×10-7mol/L。

        清除超氧陰離子溶液的制備 試劑Ⅰ(魯米諾溶液):精密量取魯米諾貯備液用碳酸緩沖液(pH 11.0)稀釋至濃度為 5.4×10-5mol/L。試劑Ⅱ(連苯三酚溶液):精密量取連苯三酚貯備液用水稀釋至濃度為1.51×10-5mol/L。

        2.5 檢測(cè)裝置示意圖

        HPLC-CL聯(lián)用系統(tǒng)是由高效液相和化學(xué)發(fā)光兩臺(tái)儀器串聯(lián)組成,主要包括HPLC(輸液泵、色譜柱、DAD檢測(cè)器)、混合器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(流通池、光電倍增管和記錄儀)及蠕動(dòng)泵(輸送化學(xué)發(fā)光溶液)等主要組成部分。兩臺(tái)儀器連接主要由不同內(nèi)徑PEEK管和T型管連接(見(jiàn)圖1)。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 HPLC-CL條件的優(yōu)化

        吸收波長(zhǎng)的選擇:采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)掃描,并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[11],最終選擇300 nm為消癌平注射液的檢測(cè)波長(zhǎng),此波長(zhǎng)下各色譜峰分離較好,干擾較小。

        流動(dòng)相的考察:HPLC-CL在線(xiàn)聯(lián)用方法,要求兩種儀器檢測(cè)條件及分析試劑的兼容性。相對(duì)于甲醇-醋酸、甲醇-磷酸、乙腈-醋酸洗脫系統(tǒng),乙腈-磷酸洗脫系統(tǒng)具有較穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度,磷酸濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度也有明顯影響[4,12-13]。試驗(yàn)最終確定使用0.1%磷酸-乙腈為洗脫系統(tǒng)。

        圖1 HPLC-CL聯(lián)用系統(tǒng) P1-高壓泵 P2-蠕動(dòng)泵 C-電腦 D-化學(xué)發(fā)光儀 TM-T型管 W-廢液 G-玻璃線(xiàn)圈Figure 1 HPLC-CL detection apparatus.P1-high pressure pump P2-peristaltic pump C-computer D-CL detector TM-mixing tee W-waste liquid G-glass coil.

        化學(xué)發(fā)光溶液濃度和pH的確定:化學(xué)發(fā)光溶液的濃度和pH對(duì)于化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的穩(wěn)定和樣品活性成分的準(zhǔn)確定量至關(guān)重要[4,14],試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)增加緩沖液的pH值和魯米諾及連苯三酚的濃度能獲得較高化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度,但要使產(chǎn)生的自由基能被活性成分快速清除,達(dá)到靈敏的檢測(cè)要求,必須有合適的試劑濃度和溶劑的pH值。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的前期實(shí)驗(yàn),對(duì)緩沖液的pH值和魯米諾、過(guò)氧化氫、連苯三酚溶液的濃度分別進(jìn)行考察,最終確定使用pH值為10.0的緩沖液和9.0×10-6mol/L魯米諾及8.8×10-7mol/L過(guò)氧化氫溶液進(jìn)行清除H2O2試驗(yàn);使用pH值為11.0的緩沖液和5.4×10-5mol/L魯米諾及1.51×10-5mol/L連苯三酚溶液進(jìn)行清除O·-2自由基試驗(yàn)。

        3.2 在線(xiàn)檢測(cè)消癌平注射液清除H2O2及O·-2 自由基活性

        樣品中成分經(jīng)色譜柱分離后,DAD檢測(cè)器和CL檢測(cè)器同步記錄色譜信號(hào)和清除自由基信號(hào)。因此,通過(guò)HPLC-CL可以同時(shí)獲得樣品的HPLC色譜圖和相應(yīng)的活性圖譜。由圖2可見(jiàn),消癌平注射液HPLC指紋圖譜中1,2,3,4號(hào)峰信號(hào)較強(qiáng),其清除H2O2能力也較強(qiáng)。在清除O2·-自由基方面,4號(hào)峰顯示較強(qiáng)的活性,1,2,3號(hào)峰較弱。清除H2O2的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度明顯高于O2·-自由基,這可能是因?yàn)镠2O2和O2·-自由基本身氧化魯米諾的能力不同,而且在這種檢測(cè)方法中,H2O2是被直接檢測(cè)的,是在檢測(cè)過(guò)程中由反應(yīng)產(chǎn)生的[4]。

        3.3 HPLC-MS 分析

        HPLC-MS/MS洗脫系統(tǒng)的確立:基于獲得穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度,3.1項(xiàng)中確定了0.1%磷酸和乙腈作為HPLC-CL的洗脫系統(tǒng),而質(zhì)譜檢測(cè)中要求使用揮發(fā)性的酸試劑,因此本文根據(jù)與2.2項(xiàng)條件相同的洗脫梯度,通過(guò)改變0.1%磷酸為0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.1% 醋酸、0.2% 醋酸,分別考察 HPLC色譜圖的變化,結(jié)果顯示使用0.2%甲酸,相應(yīng)色譜圖出峰數(shù)目和出峰順序均未改變,對(duì)色譜圖中活性物質(zhì)的歸屬?zèng)]有影響,如圖3所示。最終采用0.2%甲酸-乙腈為HPLC-MS/MS洗脫系統(tǒng)。

        圖2 消癌平注射液紫外圖譜(300 nm)及其清除H2O2和O·-自由基化學(xué)發(fā)光圖譜。(A)紫外圖譜、(B)清除2 H2O2圖譜、(C)清除O2· -自由基圖譜Figure 2 Chromatogram with UV at 300 nm detection and CL detection of Xiaoaiping based upon H2O2and O·-elimination.(A)UV detection.(B)CL detec-2 tion of Xiaoaiping based upon H2O2elimination.(C)CL detection of Xiaoaiping based upon O2·-elimination.

        圖3 流動(dòng)相為0.2%甲酸時(shí)消癌平注射液色譜圖Figure 3 Chromatogram of Xiaoaiping with the mobile phase of 0.2%formic acid

        3種綠原酸類(lèi)成分的鑒別:消癌平注射液中主要含酚酸類(lèi)物質(zhì),已知的有綠原酸等。分析HPLCMS/MS譜圖,發(fā)現(xiàn)色譜峰 1,2,3的[M-H]-離子m/z均為353。綠原酸有多種同分異構(gòu)體,但具有不同的二級(jí)質(zhì)譜特征[15-17]:3-咖啡酰奎尼酸二級(jí)質(zhì)譜有m/z 191的基峰,m/z 179峰強(qiáng)度約為基峰強(qiáng)度的50%;5-咖啡??崴岫?jí)質(zhì)譜有m/z 191的基峰,m/z 179峰強(qiáng)度小于基峰強(qiáng)度的5%,4-咖啡??崴岫?jí)質(zhì)譜有m/z 173的基峰,同時(shí)有m/z 179、191峰。圖5為3種物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜圖,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照及二級(jí)質(zhì)譜特征,推測(cè)1號(hào)峰為3-咖啡酰奎尼酸,2號(hào)峰為5-咖啡??崴?,3號(hào)峰為4-咖啡酰奎尼酸。

        圖4 消癌平注射液總離子流圖Figure 4 Total ion chromatogram of Xiaoaiping

        圖5 綠原酸同分異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖Figure 5 MS2spectra for isomeric caffeoylquinic acids

        其他物質(zhì)的分析:關(guān)于消癌平注射液中的化學(xué)成分,文獻(xiàn)報(bào)道的僅有綠原酸、咖啡酸[18]。從通關(guān)藤藥材中分離到的酚酸還有香草酸[19-20]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的HPLC-MS/MS數(shù)據(jù),推測(cè)4號(hào)峰為酚酸類(lèi)物質(zhì),但其與咖啡酸、香草酸的質(zhì)譜數(shù)據(jù)不匹配,由于文獻(xiàn)報(bào)道有限,因此關(guān)于其成分的確證有待進(jìn)一步研究。目前,關(guān)于通關(guān)藤抗癌物質(zhì)基礎(chǔ)的研究主要集中于其中的甾體類(lèi)化合物,本文未檢測(cè)到甾體類(lèi)化合物,原因可能為:含量低于檢測(cè)限;本文中HPLC流動(dòng)相只能洗脫出極性較大的化合物,極性較小的甾體類(lèi)可能未被洗脫。

        4 結(jié)語(yǔ)

        腫瘤發(fā)生與自由基密切相關(guān),消癌平注射液中酚酸類(lèi)物質(zhì)清除自由基能力較強(qiáng),提示清除自由基可能是消癌平注射液發(fā)揮抗腫瘤作用的一種途徑。

        [1]錢(qián) 軍,華海清,秦叔逵.通關(guān)藤制劑抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2009,34(1),11-13.

        [2]Dreher D,Junod A F.Role of oxygen free radicals in cancer development[J].Eur J Cancer,1996,32(1):30-38.

        [3]Kawaquchi M,F(xiàn)uruya H,Patel P M.Neuroprotective effect sof anest hetic agents[J].J Anesth,2005 ,19(2):150-156.

        [4]Ding Xiaoping,Qi Jin,Chang Yanxu,et al.Quality control of flavonoids in Ginkgo biloba leaves by high-performance liquid chromatography with diode array detection and on-line radical scavenging activity detection[J].J Chromatogr A,2009,1216:2204-2210.

        [5]Galera M M,García M D G,Valverde R S.Determination of nine pyrethroid insecticides by high-performance liquid chromatography with post-column photoderivatizationand detection based on acetonitrile chemiluminescence[J].J Chromatogr A,2006,1113:191-197.

        [6]Zhang Qunlin,Cui Hua,Aung M,et al.Sensitive determination of phenolic compounds using high-performance liquid chromatography with cerium(IV)-rhodamine 6G-phenolic compound chemiluminescence detection[J].J Chromatogr A,2005,1095:94-101.

        [7]Edyta N,Aneta W,Anatol K.Determination of catecholamines by flow-injection analysis and high-performance liquid chromatography with chemiluminescence detection[J].J Pharm Biomed A-nal,2007,43:1673-1681.

        [8]Zhou Jian,Xu Hong,Wan Guohui,et al.Enhancing and inhibiting effects of aromatic compounds on luminal-dimethylsulfoxide-OH-chemiluminescence and determination of intermediates in oxidative hair dyes by HPLC with chemiluminescence detection[J].Talanta,2004,64:467-477.

        [9]Juan M S,Manuel S.Determination of amikacin in body fluid by high-performance liquid-chromatography with chemiluminescence detection[J].J Chromatogr B,2006 ,843:20-24.

        [10]Wei Yue,Zhang Zhujun,Zhang Yantu,et al.Determination of propylthiouracil and methylthiouracil in human serum using highperformance liquid chromatography with chemiluminescence detection[J].J Chromatogr B,2007,854:239-244.

        [11]劉峰群,曹 紅,靳守東,等.通關(guān)藤注射液酚酸類(lèi)成分指紋圖譜的 HPLC 測(cè)定[J].中成藥,2003,25(3):175-178.

        [12]Cui Hua,He Caixia,Zhao Guiwen.Determination of polyphenols by high-performance liquid chromatography with inhibited chemiluminescence detection[J].J Chromatogr A,1999,855:171-179.

        [13]Toyooka T,Kashiwazaki T,Kato M.Quality control of flavonoids in Ginkgo biloba leaves by high-performance liquid chromatogra-phy with diode array detection and on-line radical scavenging activity detection[J].Talanta,2003,60:467-474.

        [14]Chang Yanxu,Yan Dongmei,Chen Linlin,et al.Potency fingerprint of herbal products danshen injection for their quality evaluation[J].Chem Pharm Bull,2009,57(6):586-590.

        [15]羅奇志,羅佳波.雙黃連粉針中化學(xué)成分的高效液相色譜-電噴霧串級(jí)質(zhì)譜分析[J].中成藥,2009,31(9):1402-1404.

        [16]Clifford M N.Johnson K L,Knight S,et al.Hierarchical schemefor LC/MSn identification of chlorogenic acids[J].J Agric Food Chem,2003,51:2900-2911.

        [17]章弘揚(yáng),王玉莉,胡 坪,等.清開(kāi)靈注射液 HPLC/UV/MS/MS指紋圖譜研究[J].中成藥,2006 ,28(4):469-473.

        [18]劉峰群,曹 紅,靳守東,等.比色法測(cè)定消癌平注射液中總酚酸的含量[J].華西藥學(xué)雜志,2003,18(3):232-234.

        [19]刑旺興.中藥通關(guān)藤活性成分的研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學(xué),2002.

        [20]雷永勝.通關(guān)藤化學(xué)成分的研究[D].沈陽(yáng):沈陽(yáng)藥科大學(xué),2008.

        猜你喜歡
        魯米諾消癌化學(xué)發(fā)光
        健脾消癌方通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌血管生成的研究
        聚(苯胺-魯米諾)/多壁碳納米管/金納米復(fù)合材料的合成及其發(fā)光性能研究
        N-烷基魯米諾的合成與光譜性質(zhì)
        河南化工(2020年11期)2020-12-10 05:39:06
        消癌平注射液提取濃縮工藝的優(yōu)化
        中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:18
        納米金催化Luminol-AgNO3化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定鹽酸阿米替林
        殼聚糖印跡樹(shù)脂固相微萃取/化學(xué)發(fā)光法在線(xiàn)測(cè)定廢水中Cr3+
        消癌平注射液用于晚期胃癌化療患者效果觀(guān)察
        基于魯米諾-過(guò)氧化氫-CdTe的流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光體系及應(yīng)用于多巴胺的檢測(cè)
        BECKMAN DxI800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)泌乳素的性能驗(yàn)證
        血催化魯米諾化學(xué)發(fā)光性能的研究
        丰满女人又爽又紧又丰满| 男人的天堂一区二av| 亚洲女同一区二区| 亚洲欧洲精品成人久久曰影片| 在线丝袜欧美日韩制服| 白白在线免费观看视频| 欧美亅性猛交内射| 亚洲精品字幕| 精品一区二区三区免费爱| 国产自拍精品在线视频| av区无码字幕中文色| 国产成人精品一区二区三区免费| 国产成人亚洲精品电影| 亚洲一区二区三区高清视频| 国产精品一区二区久久国产| a级国产精品片在线观看| 永久免费看黄在线观看| 日本精品一区二区三区二人码 | 精品国产日韩亚洲一区在线| 激情内射亚洲一区二区三区| 五月婷婷俺也去开心| 免费va国产高清不卡大片| 国产亚洲一本二本三道| 99久久99久久精品免费看蜜桃| 亚洲不卡av不卡一区二区| 中文字幕日本女优在线观看| 中文字幕亚洲综合久久综合| 天天综合网在线观看视频 | 青青草视频在线观看绿色| 久久久www成人免费毛片| 亚洲一二三区在线观看| 在线免费观看视频播放| 一区二区三区国产在线视频| 无码午夜成人1000部免费视频| 久久青草国产精品一区| 日本女优久久精品久久| 久久婷婷五月综合97色一本一本| 人妻在卧室被老板疯狂进入国产| 热热久久超碰精品中文字幕| av高清在线不卡直播| 九月婷婷人人澡人人添人人爽|