朱 卉, 朱丹妮, 余伯陽(yáng)
(中國(guó)藥科大學(xué)中藥復(fù)方教研室,江蘇南京211198)
消癌平注射液是由蘿藦科(Asclepiadaceae)牛奶菜屬植物通關(guān)藤(Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wight et Arn.)的干燥藤莖經(jīng)現(xiàn)代化工藝水提醇沉后制成,臨床用于治療原發(fā)性肝癌、食管癌和胃癌等惡性腫瘤,效果顯著[1]。腫瘤的發(fā)生與多種因素有關(guān),自由基是其中重要的因素,自由基參與人體的癌變過(guò)程。氧自由基所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷刺激腫瘤的發(fā)生[2]。研究還發(fā)現(xiàn)許多腫瘤病人的癌細(xì)胞中氧自由基清除系統(tǒng)存在障礙[3]。消癌平注射液在臨床上治療多種腫瘤獲得良好的療效,但其抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制目前仍不明確。
化學(xué)發(fā)光分析法(CL)具有靈敏度高、線(xiàn)性范圍寬、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),與高效液相色譜(HPLC)的高效分離特性相結(jié)合,成為一種有效的痕量分析技術(shù)。近年來(lái),高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光(HPLC-CL)聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅速,已用于黃酮、合成除蟲(chóng)菊脂、多酚、兒茶酚胺、芳香族化合物等的檢測(cè)[4-8],還有文獻(xiàn)報(bào)道用于檢測(cè)藥物在體內(nèi)的分布、代謝情況[9-10]。
本試驗(yàn)將HPLC-CL聯(lián)用技術(shù)用于消癌平注射液,在線(xiàn)檢測(cè)其酚酸類(lèi)物質(zhì)清除兩種氧自由基的活性,并利用HPLC-MS/MS分析技術(shù)鑒別其清除氧自由基的活性成分,為研究其抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理提供理論依據(jù)。
Agilent 1100型HPLC色譜儀(包括HP工作站、G1312A型二元泵、G1313A型全自動(dòng)微量進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G1314A型檢測(cè)器);Agilent 1100 LC/MSD Trap XCT ESI質(zhì)譜儀(Agilent Technologies,MA,USA)。
BPCL-1-G-C微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x及 BPCL Appl.7.2數(shù)據(jù)處理工作站(中國(guó)科學(xué)院北京生物物理研究所);十萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多儀器有限公司,上海,AE-240);PHS-25型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠(chǎng));BT-200恒流泵(滬西分析儀器廠(chǎng),上海)。
消癌平注射液(批號(hào)200903021,南京圣和藥業(yè)提供),綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110753-200413)。
碳酸氫鈉和無(wú)水碳酸鈉(南京化學(xué)試劑廠(chǎng),AR),乙二胺四乙酸(EDTA)(上?;瘜W(xué)試劑總廠(chǎng),標(biāo)準(zhǔn)純),3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾,luminol)(Fluka公司)。過(guò)氧化氫(30%)(南京化學(xué)試劑廠(chǎng),AR),連苯三酚(遵義第二化學(xué)廠(chǎng),AR),乙腈(美國(guó)TEDIA公司,色譜級(jí)),磷酸(南京化學(xué)試劑廠(chǎng),AR)。
消癌平注射液,取適量過(guò)0.45 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。
色譜柱:Diamonsil C18分析柱(250 mm ×4.6 mm I.D.5 μm)(Dikma Technologies)。流動(dòng)相:0.1%磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脫:0~15 min(B為2%~4%),15~20 min(B 為4% ~7%),20~35 min(B為7% ~10%),35~35.01(B 為10% ~11%),35.01~50 min(B 為11% ~11%),50~75 min(B為11% ~18%),75~100 min(B 為18% ~25%),100~105 min(B為25% ~2%)。流速1 mL/min,柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm。進(jìn)樣量:5 μL。
HPLC分析條件:0.1%磷酸改用0.2%甲酸,其它條件同2.2項(xiàng)。
質(zhì)譜分析條件:負(fù)離子檢測(cè)模式;ESI離子源;掃描范圍:m/z 100-1200。毛細(xì)管電壓3500 V,干燥氣流速9.0 L/min,溫度350℃;霧化氣壓力40 psi。數(shù)據(jù)工作站為 LC/MSD Trap Software 4.2 and Data Analysis 2.2。
碳酸緩沖液(pH 10.0 和11.0)0.1 mol/L 碳酸鈉水溶液和0.1 mol/L碳酸氫鈉水溶液按一定比例配成pH值為10.0和11.0緩沖液,分別加入 EDTA,使其濃度為6.3 ×10-3mol/L。
魯米諾貯備液 精密稱(chēng)取一定量的魯米諾,用0.1 mmol/L的碳酸鈉水溶液配制成濃度為0.018 mol/L的魯米諾貯備液,避光,4℃保存,3天后使用。
連苯三酚貯備液精密稱(chēng)取一定量的連苯三酚,用1mmol/L的鹽酸水溶液配制成濃度為0.01 mol/L的連苯三酚貯備液,避光,4℃保存。
清除過(guò)氧化氫溶液的制備 試劑Ⅰ(魯米諾溶液):精密量取魯米諾貯備液用碳酸緩沖液(pH 10.0)稀釋至濃度為 9.0 ×10-6mol/L。試劑Ⅱ(過(guò)氧化氫溶液):30%的過(guò)氧化氫溶液加水稀釋至濃度為8.8 ×10-7mol/L。
清除超氧陰離子溶液的制備 試劑Ⅰ(魯米諾溶液):精密量取魯米諾貯備液用碳酸緩沖液(pH 11.0)稀釋至濃度為 5.4×10-5mol/L。試劑Ⅱ(連苯三酚溶液):精密量取連苯三酚貯備液用水稀釋至濃度為1.51×10-5mol/L。
HPLC-CL聯(lián)用系統(tǒng)是由高效液相和化學(xué)發(fā)光兩臺(tái)儀器串聯(lián)組成,主要包括HPLC(輸液泵、色譜柱、DAD檢測(cè)器)、混合器、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(流通池、光電倍增管和記錄儀)及蠕動(dòng)泵(輸送化學(xué)發(fā)光溶液)等主要組成部分。兩臺(tái)儀器連接主要由不同內(nèi)徑PEEK管和T型管連接(見(jiàn)圖1)。
吸收波長(zhǎng)的選擇:采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)掃描,并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[11],最終選擇300 nm為消癌平注射液的檢測(cè)波長(zhǎng),此波長(zhǎng)下各色譜峰分離較好,干擾較小。
流動(dòng)相的考察:HPLC-CL在線(xiàn)聯(lián)用方法,要求兩種儀器檢測(cè)條件及分析試劑的兼容性。相對(duì)于甲醇-醋酸、甲醇-磷酸、乙腈-醋酸洗脫系統(tǒng),乙腈-磷酸洗脫系統(tǒng)具有較穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度,磷酸濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度也有明顯影響[4,12-13]。試驗(yàn)最終確定使用0.1%磷酸-乙腈為洗脫系統(tǒng)。
圖1 HPLC-CL聯(lián)用系統(tǒng) P1-高壓泵 P2-蠕動(dòng)泵 C-電腦 D-化學(xué)發(fā)光儀 TM-T型管 W-廢液 G-玻璃線(xiàn)圈Figure 1 HPLC-CL detection apparatus.P1-high pressure pump P2-peristaltic pump C-computer D-CL detector TM-mixing tee W-waste liquid G-glass coil.
化學(xué)發(fā)光溶液濃度和pH的確定:化學(xué)發(fā)光溶液的濃度和pH對(duì)于化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的穩(wěn)定和樣品活性成分的準(zhǔn)確定量至關(guān)重要[4,14],試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)增加緩沖液的pH值和魯米諾及連苯三酚的濃度能獲得較高化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度,但要使產(chǎn)生的自由基能被活性成分快速清除,達(dá)到靈敏的檢測(cè)要求,必須有合適的試劑濃度和溶劑的pH值。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的前期實(shí)驗(yàn),對(duì)緩沖液的pH值和魯米諾、過(guò)氧化氫、連苯三酚溶液的濃度分別進(jìn)行考察,最終確定使用pH值為10.0的緩沖液和9.0×10-6mol/L魯米諾及8.8×10-7mol/L過(guò)氧化氫溶液進(jìn)行清除H2O2試驗(yàn);使用pH值為11.0的緩沖液和5.4×10-5mol/L魯米諾及1.51×10-5mol/L連苯三酚溶液進(jìn)行清除O·-2自由基試驗(yàn)。
樣品中成分經(jīng)色譜柱分離后,DAD檢測(cè)器和CL檢測(cè)器同步記錄色譜信號(hào)和清除自由基信號(hào)。因此,通過(guò)HPLC-CL可以同時(shí)獲得樣品的HPLC色譜圖和相應(yīng)的活性圖譜。由圖2可見(jiàn),消癌平注射液HPLC指紋圖譜中1,2,3,4號(hào)峰信號(hào)較強(qiáng),其清除H2O2能力也較強(qiáng)。在清除O2·-自由基方面,4號(hào)峰顯示較強(qiáng)的活性,1,2,3號(hào)峰較弱。清除H2O2的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度明顯高于O2·-自由基,這可能是因?yàn)镠2O2和O2·-自由基本身氧化魯米諾的能力不同,而且在這種檢測(cè)方法中,H2O2是被直接檢測(cè)的,是在檢測(cè)過(guò)程中由反應(yīng)產(chǎn)生的[4]。
HPLC-MS/MS洗脫系統(tǒng)的確立:基于獲得穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度,3.1項(xiàng)中確定了0.1%磷酸和乙腈作為HPLC-CL的洗脫系統(tǒng),而質(zhì)譜檢測(cè)中要求使用揮發(fā)性的酸試劑,因此本文根據(jù)與2.2項(xiàng)條件相同的洗脫梯度,通過(guò)改變0.1%磷酸為0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.1% 醋酸、0.2% 醋酸,分別考察 HPLC色譜圖的變化,結(jié)果顯示使用0.2%甲酸,相應(yīng)色譜圖出峰數(shù)目和出峰順序均未改變,對(duì)色譜圖中活性物質(zhì)的歸屬?zèng)]有影響,如圖3所示。最終采用0.2%甲酸-乙腈為HPLC-MS/MS洗脫系統(tǒng)。
圖2 消癌平注射液紫外圖譜(300 nm)及其清除H2O2和O·-自由基化學(xué)發(fā)光圖譜。(A)紫外圖譜、(B)清除2 H2O2圖譜、(C)清除O2· -自由基圖譜Figure 2 Chromatogram with UV at 300 nm detection and CL detection of Xiaoaiping based upon H2O2and O·-elimination.(A)UV detection.(B)CL detec-2 tion of Xiaoaiping based upon H2O2elimination.(C)CL detection of Xiaoaiping based upon O2·-elimination.
圖3 流動(dòng)相為0.2%甲酸時(shí)消癌平注射液色譜圖Figure 3 Chromatogram of Xiaoaiping with the mobile phase of 0.2%formic acid
3種綠原酸類(lèi)成分的鑒別:消癌平注射液中主要含酚酸類(lèi)物質(zhì),已知的有綠原酸等。分析HPLCMS/MS譜圖,發(fā)現(xiàn)色譜峰 1,2,3的[M-H]-離子m/z均為353。綠原酸有多種同分異構(gòu)體,但具有不同的二級(jí)質(zhì)譜特征[15-17]:3-咖啡酰奎尼酸二級(jí)質(zhì)譜有m/z 191的基峰,m/z 179峰強(qiáng)度約為基峰強(qiáng)度的50%;5-咖啡??崴岫?jí)質(zhì)譜有m/z 191的基峰,m/z 179峰強(qiáng)度小于基峰強(qiáng)度的5%,4-咖啡??崴岫?jí)質(zhì)譜有m/z 173的基峰,同時(shí)有m/z 179、191峰。圖5為3種物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜圖,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照及二級(jí)質(zhì)譜特征,推測(cè)1號(hào)峰為3-咖啡酰奎尼酸,2號(hào)峰為5-咖啡??崴?,3號(hào)峰為4-咖啡酰奎尼酸。
圖4 消癌平注射液總離子流圖Figure 4 Total ion chromatogram of Xiaoaiping
圖5 綠原酸同分異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖Figure 5 MS2spectra for isomeric caffeoylquinic acids
其他物質(zhì)的分析:關(guān)于消癌平注射液中的化學(xué)成分,文獻(xiàn)報(bào)道的僅有綠原酸、咖啡酸[18]。從通關(guān)藤藥材中分離到的酚酸還有香草酸[19-20]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的HPLC-MS/MS數(shù)據(jù),推測(cè)4號(hào)峰為酚酸類(lèi)物質(zhì),但其與咖啡酸、香草酸的質(zhì)譜數(shù)據(jù)不匹配,由于文獻(xiàn)報(bào)道有限,因此關(guān)于其成分的確證有待進(jìn)一步研究。目前,關(guān)于通關(guān)藤抗癌物質(zhì)基礎(chǔ)的研究主要集中于其中的甾體類(lèi)化合物,本文未檢測(cè)到甾體類(lèi)化合物,原因可能為:含量低于檢測(cè)限;本文中HPLC流動(dòng)相只能洗脫出極性較大的化合物,極性較小的甾體類(lèi)可能未被洗脫。
腫瘤發(fā)生與自由基密切相關(guān),消癌平注射液中酚酸類(lèi)物質(zhì)清除自由基能力較強(qiáng),提示清除自由基可能是消癌平注射液發(fā)揮抗腫瘤作用的一種途徑。
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