趙鴻賓， 陳華國，2， 周 欣，2*， 龔小見，2， 何 艷， 趙 楊

（1.貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州 貴陽 550001；2.貴州師范大學(xué)貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550001）

中藥虎杖為蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc)的干燥根和根莖，具有祛風(fēng)利濕、散瘀定痛、止咳化痰等功效。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［2］，虎杖的有效成分主要為蒽醌類和二苯乙烯類化合物，其中二苯乙烯類中的白藜蘆醇和白藜蘆醇苷獨(dú)特功效引起人們的廣泛關(guān)注；蒽醌類中的大黃素、大黃素甲醚具有抗菌活性和保肝、瀉下作用，臨床應(yīng)用極其廣泛。目前市場上已有以該植物入藥的中成藥制劑上市，如:天獅活力康膠囊，紫金膠囊，納貝益生膠囊等。隨著醫(yī)藥、化工和食品領(lǐng)域日益增長的需求，對虎杖提取物的需求量也越來越大。文獻(xiàn)關(guān)于白藜蘆醇的提取工藝研究較多，多以白藜蘆醇的含量為指標(biāo)確定工藝條件，本實(shí)驗(yàn)以白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的含量作為指標(biāo)考查不同工藝的提取方法和富集方法，并在此基礎(chǔ)上建立了同時(shí)測定虎杖提取物中3個主要成分含量的RP-HPLC測定方法。

1 儀器、試劑與藥品

儀器:Agilent 1100高效液相色譜儀(四元泵，DAD檢測器，自動進(jìn)樣器)；十萬分之一天平(梅特勒托利多)；試劑:甲醇(美國Tedia公司，色譜純；天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙酸乙酯、石油醚(天津大茂化學(xué)試劑廠)；重蒸去離子水(實(shí)驗(yàn)室制備)；對照品:白藜蘆醇(批號:111535-200502)、大黃素(批號:0756-9908)、大黃素甲醚(批號:0758-200206)均由中國藥品生物制品檢定所提供；樣品:虎杖提取物來自白藜蘆醇提取工藝所得提取物(1-7號樣品為40%乙醇提取后用石油醚-乙酸乙酯萃取，其余樣品為乙酸乙酯提取后用醇溶水沉除雜)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝路線 (見圖1)

圖1 工藝路線圖

2.2 含量測定方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm 5 μm)；流動相:(A)H2O 與(C)CH3OH梯度洗脫；0～20 min，C(%)30→50；20 ～30 min，C(%)50→100；30 ～40 min，C(%)50→100，流速:1 mL/min；柱溫:30℃；檢測波長:303 nm；參比波長360 nm。在上述色譜條件下，供試品中的白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚完全達(dá)到基線分離，分離度大于1.5，按白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚峰計(jì)算理論板數(shù)均在4000以上。

2.2.2 對照品溶液的制備 取減壓干燥至恒重的白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含白藜蘆醇0.21 mg、大黃素0.04 mg和大黃素甲醚0.03 mg的混合對照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取提取物10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，稱重，超聲處理15 min，放冷，搖勻，補(bǔ)足減失重量，用0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取2.2.2項(xiàng)下的混合對照品溶液 0.5、1、2、5、10、15、20 μL，按 2.1 項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣分析，以對照品的進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為:白藜蘆醇Y=4706.4X+43.323，r=0.9998，表明白藜蘆醇進(jìn)樣量在0.105～4.2 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；大黃素Y=2595.9X+21.057，r=0.9995，表明大黃素進(jìn)樣量在0.02～0.8 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；大黃素甲醚Y=2602.8X－2.5468，r=1.0000，表明大黃素甲醚進(jìn)樣量在0.015～0.6 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見圖2。

圖2 HPLC色譜圖

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下的混合對照品溶液20 μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果白藜蘆醇RSD=1.8%，大黃素RSD=0.3%，大黃素甲醚RSD=0.2%，說明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h 精密吸取 20 μL 注入液相色譜儀，測得峰面積，結(jié)果白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的RSD分別為1.2%、1.0%、1.3%，表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號樣品(編號8，乙酸乙酯回流提取)6份，按2.2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法分別制備供試液，測定3個成分的含量，結(jié)果白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的平均含量分別為:24.7%、14.9%、3.4%；RSD分別為 1.02%、0.95%、0.87%，結(jié)果表明，該試驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱定已知含量的虎杖提取物，分別加入一定體積的白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚對照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚回收率分別為98.9%、98.3%、102.3%，RSD分別為2.3%、1.8%、2.2%(見表1～3)。

表1 白藜蘆醇回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 大黃素回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 大黃素甲醚回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.9 樣品測定 取10批虎杖提取物，按照上述含量測定方法測定，測定結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果(n=3)

2.2.10 主成分分析(PCA) 對2.1項(xiàng)下不同提取工藝所得提取物樣品進(jìn)行主成分分析，分析結(jié)果如下(見圖3):

圖3 PCA圖

由主成分分析結(jié)果可見:10個提取工藝被分為兩類，工藝8、9、10分為一類，其余為一類。

2.2.11 聚類分析(HCA) 對2.1項(xiàng)下不同提取工藝所得提取物樣品進(jìn)行主成分分析，分析結(jié)果如下(見圖4):

由聚類分析結(jié)果可見:10個提取工藝被分為兩類，即工藝2、3、5分為B類，其余為A類；在A類中工藝8單獨(dú)為一類，即A-2類，其余為A-l類。

圖4 HCA圖

3 討論

3.1 通過對2.1項(xiàng)下不同提取工藝所得提取物進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示選用40%乙醇與乙酸乙酯作為提取溶劑，白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的提取率和在提取物中含量有較大差異，采用乙酸乙酯提取時(shí)，3個成分的提取率和含量相對較高。而在聚類分析中，大致分為兩類，即A、B類；在A類中，8、9、10 號樣品采用乙酸乙酯提取，在 B 類中，2、5、3號樣品采用40%乙醇回流，同樣顯示了提取溶劑對提取效果的影響較大，結(jié)果是選用乙酸乙酯提取效果較好。

3.2 通過分析可知，醇溶水沉(9、10號樣品)對粗提物中各成分的含量影響不大，而選用石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行萃取有助于白藜蘆醇的純化，減小有機(jī)溶劑的極性(1、2、3號樣品)可同時(shí)提高3種成分的含量，而白藜蘆醇的含量變化最大，由此可知提取物中水溶性的成分含量較高。通過對4、5號樣品結(jié)果分析表明萃取過程中乳化現(xiàn)象對各成分的含量會有較大影響，所以為防止乳化可對粗提物進(jìn)行浸提。

3.3 本工藝在前人的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，既提高了提取物中有效成分的含量，又使工藝簡單化；此含量測定方法能準(zhǔn)確、快速地測定虎杖提取物中白藜蘆醇、大黃素和大黃素甲醚的含量，且分離效果好，可用于虎杖提取物質(zhì)量控制。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:145.

［2］劉 丹，湯海峰，張三奇，等.虎杖中有效成分提取方法的研究［J］. 中成藥，2007，29(4):516-521.

［3］齊 輝，張 勉，王崢濤.HPLC同時(shí)測定虎杖中4種成分的含量［J］. 中國中藥雜志，2006，31(23):2003-2005.

［4］江 曙，朱蓉蓉，張 芳，等.虎杖中白藜蘆醇提取方法及工藝的優(yōu)化［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(3):197-199.

［5］楊漢榮，李來生，陳雄泉.高效液相色譜法測定虎杖中白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和游離大黃素［J］.理化檢驗(yàn) －化學(xué)分冊，2008，44(3):234-236.