何新榮， 劉 萍

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院藥品保障中心中藥房，北京100853)

烏靈膠囊為發(fā)酵烏靈菌粉制成的膠囊，其主要的成分是腺苷、多糖、多種氨基酸，其中有多種為人體不能自身合成的必需氨基酸?！吨袊?guó)藥典》收載了其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)為高效液相色譜法測(cè)定腺苷的含量(為新增的方法)和紫外分光光度法測(cè)定多糖的含量［1］。查閱烏靈膠囊相關(guān)文獻(xiàn)［2-6］，氨基酸類成分是烏靈膠囊的主要成分之一，但關(guān)于其相關(guān)含量測(cè)定研究甚少。為了更科學(xué)地控制烏靈膠囊的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)烏靈膠囊中多種氨基酸的含量進(jìn)行了定量測(cè)定，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)有效的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó))，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，數(shù)據(jù)由Agilent Chemstation on-line系統(tǒng)處理，G1315D熒光檢測(cè)器(FLD)，色譜柱為 Alltima C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。電子天平(Sartorius CP225D);PHS-2C計(jì)(上海虹益儀器儀表);KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器)。

1.2 試藥 天門冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Iso)、亮氨酸(Leu)、胱氨酸(Cys)、色氨酸(Try)、賴氨酸鹽酸鹽(Lys-HC)對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):624-200104);γ-氨基丁酸(γ-GABA，026K0736);烏靈膠囊(浙江佐力藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):20071203，20071204，20080306，20080308);磷酸氫二鈉、鄰苯二甲醛(phthalaldehyde，OPA)、2-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，2-MCE)均購(gòu)于Sigma公司;甲醇為國(guó)產(chǎn)色譜純?cè)噭?硼酸、磷酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Alltima C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為 A:磷酸氫二鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH=6.86)，B:甲醇;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;發(fā)射波長(zhǎng):340 nm，檢測(cè)波長(zhǎng):450 nm。梯度洗脫溶劑比例見表1。

表1 梯度洗脫溶劑比例

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取14種氨基酸對(duì)照品，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，配成每1 mL含氨基酸200 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 取4個(gè)批號(hào)烏靈膠囊各10粒，傾出內(nèi)容物，研勻，分別取0.5 g，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加20 mL 0.1 mol/L HCl溶液，超聲振蕩提取20 min，放冷，過濾，濾渣再用20 mL 0.1 mol/L的HCl溶液超聲提取20 min。合并兩次提取液，用雙蒸水定容至50 mL，濾過，濾液再用0.45 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為待測(cè)樣品，備用。

2.4 衍生試劑的制備 精密稱定12.5 mg OPA，0.25 mL甲醇溶解后，加入2.5 mL 硼酸緩沖液(0.4 mol/L，pH=9.5)，蝸漩混勻，再加入 10 μL β-巰基乙醇，冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系 取2.2項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品試液、0.1 mol/L 鹽酸溶液稀釋成 6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 nmol/mL。按2.1 項(xiàng)下色譜條件，柱前衍生法進(jìn)樣5μL進(jìn)行檢測(cè)，以氨基酸峰面積(A)為橫坐標(biāo)，氨基酸濃度(C)為縱坐標(biāo)運(yùn)用Agilent校正功能進(jìn)行線性回歸，回歸方程詳見表2，結(jié)果表明，14種氨基酸均在一定檢測(cè)濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，柱前衍生法(編輯Agilent1200進(jìn)樣程序，先抽取衍生試劑，接著抽取供試品試液，混合后靜至2 min，進(jìn)樣)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣量5 μL。記錄14種氨基酸峰面積和保留時(shí)間，其RSD分別為0.18%～1.32%和0.21% ～2.09%。表明精密度良好。

表2 氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照2.3項(xiàng)下制備樣品溶液的方法平行制備5份樣品溶液，分別按照2.1項(xiàng)下色譜條件，柱前衍生法進(jìn)樣5μL。記錄14種氨基酸峰面積和保留時(shí)間，其RSD分別為0.21% ～2.12%和0.31% ～2.14%。表明重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 烏靈膠囊樣品提取液分別于提取后 0、30、60、90、120、150 min(柱前衍生法)進(jìn)樣，記錄各種氨基酸的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD為0.42% ～1.87%，顯示烏靈膠囊的鹽酸水提液中氨基酸在150 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.5 回收率實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收試驗(yàn)。取6份已知氨基酸含量的烏靈膠囊粉末，各加入對(duì)照品溶液按2.3項(xiàng)下處理樣品，衍生后測(cè)定，計(jì)算回收率。各氨基酸的回收率在90.34% ～99.52%之間，RSD為0.80% ～1.99%。

2.6 樣品含量分析

將2.3項(xiàng)下制備的供試液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，在線柱前衍生法進(jìn)樣。

圖1表明，15種氨基酸都存在于烏靈膠囊中，除His與Gly不能分離開外，各氨基酸分離度較好，空白雜質(zhì)峰(衍生劑峰)對(duì)測(cè)定無影響。從表3中含量數(shù)據(jù)可知，γ-GABA含量最高，Met含量最低。其中以His計(jì) His與Gly的含量，大部分氨基酸在4個(gè)批次中的含量標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，表明各批次樣品含量控制穩(wěn)定，也說明了本方法有很好的實(shí)用性。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品A、烏靈膠囊樣品B與空白對(duì)照組C的HPLC-FLD色譜圖

3 討論

在植物藥中氨基酸是重要的有效成分，其中谷氨酸可促進(jìn)人體內(nèi)消化液的分泌，具有預(yù)防貧血及解毒作用;精氨酸可控制體內(nèi)細(xì)胞的退化;胱氨酸是毛發(fā)的成分，具有促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)和防止皮膚老化作用，也可用于抗過敏、肝炎、白血球減少等癥;蘇氨酸在人體內(nèi)有轉(zhuǎn)變氨基酸達(dá)到平衡的作用［7］;特別是γ-GABA，作為腦中抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，是腦內(nèi)睡眠覺醒系統(tǒng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，有可能是烏靈膠囊發(fā)揮鎮(zhèn)靜、安神作用的重要基礎(chǔ)物質(zhì)，因此正確地利用和進(jìn)一步研究監(jiān)控這些氨基酸，對(duì)充分發(fā)揮烏靈膠囊等靠氨基酸發(fā)揮治療作用的藥物價(jià)值具有重要意義。

OPA衍生化方法是目前使用較為廣泛的衍生技術(shù)［8］，具有樣品制備簡(jiǎn)單、衍生化反應(yīng)迅速、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其pH值大小在本實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要，OPA衍生化反應(yīng)要求pH＞9，因?yàn)樵趐H 5～6時(shí)衍生產(chǎn)物最易降解［9-11］。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-FLD法，柱前衍生進(jìn)樣對(duì)4個(gè)批次烏靈膠囊中14種氨基酸的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確，精密度高，重現(xiàn)性好，操作較為簡(jiǎn)單方便，尤其是流動(dòng)相較其他報(bào)道文獻(xiàn)［3，6］有了很大改進(jìn)，避免了復(fù)雜的流動(dòng)相配制工作，因此本方法可用于烏靈膠囊中氨基酸的含量測(cè)定。同時(shí)我們也對(duì)烏靈膠囊中其它氨基酸進(jìn)行了檢測(cè)，可能由于不含或含量低，未能檢測(cè)出。

表3 4批次烏靈膠囊中氨基酸的含量測(cè)定結(jié)果

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:397.

［2］吳強(qiáng)恩，鄭力行.反相高效液相色譜熒光法測(cè)定大鼠腦組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2005，32(3):355-358.

［3］張孝松，儲(chǔ)著銀，黃 龍.柱前衍生-反相高效液相色譜分析復(fù)方氨基酸注射液［J］.藥物分析雜志，1996，16(1):6-9.

［4］裘 濤，陳 眉，陶水良.烏靈菌粉對(duì)腦卒中后抑郁大鼠海馬區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及行為學(xué)改變的影響［J］.中國(guó)新藥雜志，2007，16(11):857-860.

［5］廖名龍，郁 杰.烏靈膠囊［J］.中國(guó)新藥雜志，2000，9(11):797-799.

［6］陳宛如，方鴻峰，馬志章，等.真菌中藥烏靈參化學(xué)成分的初步研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，1990，11(25):847-849.

［7］岳云飛，王振月，王謙博.柱前衍生反相高效液相色譜法測(cè)定毛脈酸模根中氨基酸的含量［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(9):2069-2070.

［8］Tcherkas YV，Kartsova LA，Krasnova IN.Analysis of amino acids in human serum by isocratic reversed-phase high-performance liquid chromatography with electrochemical detection［J］.Chromatogr A，2001，913:30.

［9］盛國(guó)慶，張晉蓉，顏 梅.高效液相測(cè)定氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的方法探討［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，20(1):34.

［10］Qu Y，Arckens L，Vandenbussche E.Simultaneous determination of total and extracellular concentrations of the amino acid neurotransmitters in cat visual cortex by microbore liquid chromatography and electrochemical detection［J］.Chromatogr A，1998，798(1-2):1.

［11］Ibolya MP.Derivatization and chromatographic behavior of the ophthaldialdehyde amino acid derivatives obtained with various SH-group-containing additives［J］.Chromatogr A，2001，913:283.