李瑞雪 汪泰初 賈鴻英 胡 飛

(1安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所,安徽合肥 230061; 2安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保研究所,安徽合肥 230061)

桑黃(Phellinusigniarius)又名桑耳、胡孫眼和桑黃菇,是一類具有重要藥用價值的大型真菌,屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、層孔菌屬[1]。桑黃的藥用價值早在《本草綱目》中就有記載,中醫(yī)認為桑黃性甘、平、味苦、味辛,入血分以化瘀,瘀血循經(jīng)而行出血止,有化瘀之功效,用于治療血崩、血淋、脫肛瀉血、帶下、閉經(jīng)、脾虛泄瀉等[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明:桑黃中的活性成分具有抗菌、抗癌、保肝、提高免疫力的功效[3-7],是目前國際公認的生物抗癌領(lǐng)域中療效非常好的藥用真菌;同時,桑黃幾乎無毒副作用,是開發(fā)保健食品的重要原料,因此已成為藥用真菌研究領(lǐng)域的一個熱點。

由于桑黃菌生理狀態(tài)的特殊性和復(fù)雜性,生長周期又很長,需 3～4年[8],并且桑黃的生長對外部環(huán)境有一定的要求,故野生的成熟子實體很少。目前,市場上的桑黃大多以桑黃子實體及其粗加工的制品形式出現(xiàn),在國際醫(yī)藥市場上價格昂貴、供不應(yīng)求。利用液體發(fā)酵技術(shù),可以在短期內(nèi)獲得大量的桑黃菌絲體,從而降低桑黃的開發(fā)成本,這對于保護天然資源、解決桑黃子實體資源缺乏、服務(wù)醫(yī)療保健、滿足市場需要、提高社會和經(jīng)濟效益等,均具有十分重要的意義。為此,我們對利用液體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)桑黃的工藝條件進行了優(yōu)化,以期為提高桑黃產(chǎn)量、生產(chǎn)與利用桑黃及其開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料及主要試劑

1.1.1 試驗菌種 桑黃菌種 L6由安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院糖復(fù)合物與糖工程實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 ①斜面母種培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基):馬鈴薯 200g/L,葡萄糖 20g/L,瓊脂20g/L,蒸餾水定容。②液體種子培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基):馬鈴薯 200g/L,葡萄糖 20g/L,蒸餾水定容。③碳源優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基:蛋白胨 10g/L,酵母粉10g/L,蒸餾水定容。④氮源優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖40g/L,蒸餾水定容。碳、氮源及無機鹽等生物試劑為國產(chǎn)化學(xué)純。

1.1.3 試驗儀器 手提式壓力蒸汽滅菌器 YXQ.S G4/280型(上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司),全溫振蕩培養(yǎng)箱 HZP-250型(上海精宏實驗設(shè)備有限公司),循環(huán)水式真空泵 SHZ-D型(河南鞏義英豫華儀器廠),電熱鼓風(fēng)干燥箱(南京實驗儀器廠),梅特勒電子天平 AE200型(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 桑黃菌種的培養(yǎng)方法

1.2.1 母種的活化 將保存的桑黃的菌種接種到斜面母種培養(yǎng)基上,在恒溫光照培養(yǎng)箱中 26℃的條件下培養(yǎng) 8d后,活化 2次備用。

1.2.2 液體種子的制備 在 250mL三角瓶中裝入100mL液體種子培養(yǎng)基,將活化 2次的 L6斜面菌株取一定量菌絲接入液體種子培養(yǎng)基上,在全溫震蕩培養(yǎng)箱 26℃、140r/min,培養(yǎng) 5d,再用高速分散器將菌絲打碎,獲得桑黃菌種子液備用。

1.3 菌絲體生物量的測定

用布氏漏斗真空抽濾搖瓶發(fā)酵醪,用蒸餾水反復(fù)沖洗 3次菌體后,收集濕菌體置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中,用 50(±5)℃烘干至恒重后,用電子天平準確稱其質(zhì)量(精確至 0.001g),得菌絲體干物質(zhì)量(即生物量,單位 mg/mL)。

1.4 培養(yǎng)桑黃工藝的優(yōu)化

1.4.1 培養(yǎng)基碳源的選擇 將供試碳源,麥芽糖、葡萄糖、白砂糖、蔗糖、麩皮、玉米粉、甘油(其中麩皮、玉米粉煮沸 20min,2層紗布過濾,取濾液)按40g/L的比例,分別加入碳源優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基,用250mL三角瓶裝入 100mL培養(yǎng)基,按 15%接種量分別接種備用的桑黃菌種液,于 26℃,140r/min的振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7d后,測定桑黃菌絲體生物量。

1.4.2 培養(yǎng)基氮源的選擇 供試氮源 9種,分別為蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、蠶蛹粉、馬鈴薯、黃豆粉、NaNO3、(NH4)2SO4、NH4NO3(其中蠶蛹粉、馬鈴薯 、黃豆粉煮沸 20min,2層紗布過濾,取濾液)。它們在配制 1L培養(yǎng)基中的添加量,根據(jù)各自的全氮含量相對于 10g蛋白胨的含氮量進行折算(不同氮源全氮含量如表 1),分別加入氮源優(yōu)化基礎(chǔ)培養(yǎng)基,按 1.4.1的接種方法和培養(yǎng)條件培養(yǎng) 7d后,測定桑黃菌絲體生物量。

表1 配制 1L培養(yǎng)基中不同氮源的添加量

1.4.3 培養(yǎng)基濃度配比優(yōu)化正交試驗 為了進一步探討培養(yǎng)基中碳源、氮源和營養(yǎng)生長因子等各成分的交叉影響,根據(jù)確定的最佳碳源—玉米粉、最佳氮源—馬鈴薯、KH2PO4及絲氨酸做營養(yǎng)生長因子,設(shè)計了一個 4因素 3水平的正交表 L9(34),各因素、水平見表 2。按 1.4.1的接種方法和培養(yǎng)條件培養(yǎng) 7d后,測定桑黃菌絲體生物量。

表2 培養(yǎng)基正交因素水平表

1.4.4 非營養(yǎng)性因素的選擇與優(yōu)化 培養(yǎng)最適溫度的選擇:利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng),接入菌種后,分別在 25、26、27、28、29 ℃的溫度條件下,自然初始 pH值,140r/min的振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7d,分別測定 L6菌絲體生物量,確定最適溫度。

初始 pH值的選擇:將基礎(chǔ)培養(yǎng)基的 pH值分別調(diào)至 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,接入菌種,于27℃下 140r/min的振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7d,分別測定L6菌絲體生物量,確定最適 pH值。

培養(yǎng)時間的選擇:利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng),接入菌種后,于 27℃下 140r/min的振蕩培養(yǎng)箱,自培養(yǎng)第1天起,每隔 24h測定 1次 L6菌絲體生物量,連續(xù)測 12d,確定最適培養(yǎng)時間。

種齡、接種量、裝液量及轉(zhuǎn)速的優(yōu)化:為綜合確定種齡、裝液量、接種量和培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)速各條件參數(shù),設(shè)計了一個 4因素 3水平的正交試驗,各因素、水平見表 3。利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基接入菌種后,分別于初始pH值 6.0,27℃,培養(yǎng) 6d,分別測定 L6菌絲體生物量,確定最適種齡、接種量、裝液量及轉(zhuǎn)速。

表3 培養(yǎng)條件正交因素水平表

1.5 培養(yǎng)工藝優(yōu)化前后菌絲體生物量比較

優(yōu)化前培養(yǎng)工藝:培養(yǎng)基為馬鈴薯 200g/L、葡萄糖 20g/L,蒸餾水定容;培養(yǎng)條件為在自然初始 pH值、搖床轉(zhuǎn)速 140r/min、培養(yǎng)溫度 26℃條件下,將培養(yǎng) 4d的液體母種以 15%的接種量,接種到裝有100mL液體培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中,培養(yǎng) 7d。

優(yōu)化后培養(yǎng)工藝:培養(yǎng)基為玉米粉30g/L、馬鈴薯 300g/L、KH2PO40.5g/L、絲氨酸 1.0g/L,蒸餾水定容;培養(yǎng)條件為在初始 pH值 6.0、搖床轉(zhuǎn)速130r/min、培養(yǎng)溫度 27℃條件下,將培養(yǎng) 3d的液體母種以 15%的接種量,接種到裝有 100mL液體培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中,培養(yǎng) 6d。在培養(yǎng)工藝優(yōu)化前后 2種條件下,液體培養(yǎng)桑黃 L6菌種,分別測定菌絲體生物量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基碳源的選擇

從圖 1可以看出,培養(yǎng)基中利用不同的碳源培養(yǎng),對 L6菌絲體生物量有較大影響,其中以玉米粉作為碳源時,L6菌絲體生物量最高,達 12.040mg/mL,葡萄糖、麥芽糖做碳源時產(chǎn)量也較高。但從生產(chǎn)成本考慮,玉米粉價格低廉,來源廣泛,適合工業(yè)化生產(chǎn),故確定玉米粉為 L6液體培養(yǎng)最佳碳源。

圖1 不同碳源對 L6菌絲體生物量的影響

2.2 培養(yǎng)基氮源的選擇

培養(yǎng)基中利用不同的氮源培養(yǎng),桑黃菌絲體生物量有顯著的差異(圖 2),其中以馬鈴薯作氮源時其菌絲體生物量最高,為 12.510mg/mL;因此,本試驗確定馬鈴薯為 L6液體培養(yǎng)最佳氮源。另外黃豆粉作氮源生物量也較高,故可選用黃豆粉做氮源來拓寬可用的氮源領(lǐng)域。試驗還發(fā)現(xiàn)無機氮源不利于L6的生長,估計這與無機鹽中的氮不能被菌株有效吸收利用有關(guān)。

圖2 不同氮源對L6菌絲體生物量的影響

2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗結(jié)果

試驗結(jié)果見表 4,根據(jù)各因素 k的變化率可以看出各因素的較優(yōu)組合為 D1C2B3A2,綜合考慮確定 L6液體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為:玉米粉 30g/L,馬鈴薯 300g/L,KH2PO40.5g/L,絲氨酸 1.0g/L。從表 5方差分析結(jié)果可以看出,各因素對 L6菌絲體生物量的影響程度由大到小依次為 D、C、B、A因素,其中 D、C因素在 99%的置信度下有極顯著影響(P＜0.01),B、A因素在 95%的置信度下有顯著影響(P＜0.05)。

表4 L6液體發(fā)酵培養(yǎng)基配比優(yōu)化正交試驗結(jié)果

表5 L6液體發(fā)酵培養(yǎng)基配比優(yōu)化正交試驗結(jié)果方差分析

2.4 非營養(yǎng)性因素的選擇與優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)溫度 從用 5個不同的溫度進行液體培養(yǎng)的結(jié)果看(圖 3),27℃時菌絲體生物量最高,達 9.528mg/mL,溫度過高過低均不利于菌株生長,故選擇 27℃為最佳發(fā)酵培養(yǎng)溫度。

圖3 培養(yǎng)溫度對 L6菌絲體生物量的影響

2.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)初始 pH值 由于 pH值影響到菌絲體的通透性、對微量元素的吸收及各種酶的活性;因此,在發(fā)酵生產(chǎn)時 pH值通常被作為一項重點檢測參數(shù)。選擇最適初始 pH值的原則是既有利于菌株的生長繁殖,又可以最大限度地獲得高的產(chǎn)量。從用不同的初始 pH值進行液體培養(yǎng)的結(jié)果看(圖4),初始 pH值為 6.0時,L6菌株生長良好,菌絲體生物量最高,當(dāng)初始 pH值大于 6.5時,菌絲體生物量有明顯下降,說明在偏堿性條件下不利于菌株的生長。最終確定液體培養(yǎng)最佳初始 pH值為 6.0。

圖4 初始pH值對L6菌絲體生物量的影響

2.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)時間 由圖 5可以看出,隨著培養(yǎng)時間的增加,L6菌絲體生物量不斷增加,第 7天時產(chǎn)量最高,達 9.578mg/mL;其中第 6天產(chǎn)量為9.510mg/mL,略低于第 7天時的產(chǎn)量,此后隨著培養(yǎng)時間的延長產(chǎn)量開始逐漸下降,原因可能是培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡,菌體衰亡而影響了菌株生長?？紤]到培養(yǎng)時間的延長會增加生產(chǎn)成本,故確定 6d為最佳培養(yǎng)時間。

圖5 培養(yǎng)時間對L6菌絲體生物量的影響

2.4.4 種齡、接種量、裝液量及培養(yǎng)箱的轉(zhuǎn)速對 L6菌絲體生物量的影響 從表 6-7及方差分析結(jié)果可以看出,各因素對 L6菌絲體生物量的影響程度由大到小依次為 E、G、F、H因素,其中 E、G因素在95%的置信度下有顯著影響(P＜0.05),F、H因素?zé)o顯著影響。根據(jù)各因素 k的變化率可以看出最佳因素搭配為 E1G2F2H1,即以菌絲體生物量為指標,L6液體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)條件是:將培養(yǎng) 3d的液體母種以 15%的接種量,接種到裝有 100mL液體培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中,在 130r/min、27℃條件下培養(yǎng) 6d。

2.5 培養(yǎng)工藝優(yōu)化前后菌絲體生物量比較

在培養(yǎng)工藝優(yōu)化前后 2種條件下,液體發(fā)酵培養(yǎng) L6,分別測定 L6的菌絲體生物量,用優(yōu)化前的工藝條件培養(yǎng) L6菌絲體生物量為 9.240mg/mL,用優(yōu)化后的工藝條件培養(yǎng) L6菌絲體生物量可高達16.687mg/mL,比優(yōu)化前提高了 80.6%。經(jīng) SPSS統(tǒng)計分析軟件對結(jié)果進行分析可知,P＜0.01,兩者差異極顯著。

表6 L 6液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗結(jié)果

表7 L 6液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗結(jié)果方差分析

3 小結(jié)與討論

從微生物的營養(yǎng)因素要求來看,所有的微生物都需要碳源、氮源、無機鹽及生長因子,微生物的生長發(fā)育過程也需要大量的微量元素,另外有些產(chǎn)品的生產(chǎn)還需要使用誘導(dǎo)劑、前體和促進劑。在實驗室規(guī)模上配制含有純化合物的培養(yǎng)基是相當(dāng)簡單的,雖然它能滿足微生物的生長需求,但在大規(guī)模生產(chǎn)中往往不適合,而研究桑黃生長的培養(yǎng)條件時,其基本宗旨是給以后工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù);因此,在培養(yǎng)條件的篩選上,力求篩選出既可以最大限度地提高產(chǎn)量,又使用廉價的原材料,從而降低生產(chǎn)成本。

通過單因素篩選及正交試驗確定,優(yōu)化后的最佳液體培養(yǎng)基配方:玉米粉 30 g/L,馬鈴薯 300 g/L,KH2PO40.5 g/L,絲氨酸 1.0 g/L;最佳培養(yǎng)條件:在初始 pH值 6.0、搖床轉(zhuǎn)速 130 r/min、培養(yǎng)溫度27℃條件下,將培養(yǎng)3 d的液體母種以 15%的接種量,接種到裝有 100m L液體培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中,培養(yǎng) 6 d。優(yōu)化后桑黃產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了80.6%。從本試驗看,在優(yōu)化的液體培養(yǎng)工藝下,雖然桑黃 L6菌絲體生物量比優(yōu)化前提高了 80.6%,但菌株L6的產(chǎn)量還不是很高;為了進一步提高其產(chǎn)量,今后還需要通過對其具體的代謝途徑,添加合適的誘導(dǎo)物、刺激物等方面作進一步的研究。

[1]孫淑靜,江玉姬,朱虎,等.藥用真菌桑黃的研究現(xiàn)狀[J].藥物生物技術(shù),2005,12(2):138-140.

[2]劉波.中國藥用真菌[M].太原:山西人民出版社,1974.

[3]宋力,孫培龍,郭彬彬,等.桑黃的研究進展[J].中國食用菌,2005,24(3):7-11.

[4]溫克,陳勁,李紅,等.桑黃等四種抗癌藥物活性比較[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2002,28(3):247-249.

[5]Kim G Y,Lee JY,Lee JO,et a1.Paritial characterization and immunostimulatory effect of a novel polysaccharide-protein comlex extracted from phellinus linteus[J].Biosci Biotechnol Biochem,2006,70(5):1218-1226.

[6]劉春輝,陳體強,林躍鑫.藥用真菌桑黃的研究進展[J].菌物研究,2004,2(2):53-59.

[7]孫培龍,徐雙陽,楊開,等.珍稀藥用真菌桑黃的國內(nèi)外研究進展[J].微生物學(xué)通報,2006,33(2):119-123.

[8]戴玉成.藥用擔(dān)子菌——鮑氏層孔菌(桑黃)的新認識[J].中草藥,2003,34(1):942-951.