白 月 徐國興 莊 華 謝茂松 郭 健 王婷婷

誘導(dǎo)MSCs轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細胞的應(yīng)用

白 月 徐國興 莊 華 謝茂松 郭 健 王婷婷

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福建省眼科研究所

近年來，人們研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在體外可經(jīng)生長因子誘導(dǎo)，抗氧化劑誘導(dǎo)，中藥誘導(dǎo)，增加細胞內(nèi)cAMP等不同途徑的誘導(dǎo)方法，分化為神經(jīng)外胚層來源的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞，因此一些研究者嘗試以上誘導(dǎo)途徑使MSCs分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細胞，用于體內(nèi)相關(guān)疾病的細胞替代治療，為多種疾病帶來了新的治療思路。

骨髓間充質(zhì)干細胞 體外誘導(dǎo) 視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細胞

胚胎干細胞具有發(fā)育全能性，理論上可誘導(dǎo)分化為機體所需的任何組織或器官，但涉及倫理學(xué)問題，以往受到很大限制，發(fā)展緩慢。應(yīng)用眼色素上皮緣的視網(wǎng)膜干細胞[1]及鼠腦神經(jīng)先祖細胞移植[2]也由于供體組織有限性及安全性問題，不利于治療視網(wǎng)膜疾病的開展。于是有人把目光投向成體干細胞中的MSCs，成年動物骨髓有2類干細胞群：造血干細胞和間充質(zhì)干細胞。最初因其容易貼壁呈成纖維細胞樣克隆生長，被稱為成纖維細胞集落形成單位（CFU-F）[3],后來研究發(fā)現(xiàn)它是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，在體內(nèi)外均具支持和調(diào)控造血的作用，且具有多向分化潛能，故又稱其為間充質(zhì)干細胞[4]。也稱為骨髓基質(zhì)細胞[5]。

MSCs的特點為:①來源于中胚層，可以跨系統(tǒng)甚至跨胚層分化為3個胚層來源的細胞，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源組織的細胞（視網(wǎng)膜來源于胚胎期神經(jīng)外胚層），并且經(jīng)過20~30次細胞分裂后，這種分化特性也不會消失[6]。②分離培養(yǎng)方便。③由于不表達T細胞識別的細胞表面標志，植入后不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。④易于轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定高效表達外源基因優(yōu)點[7],因此可把利于定向分化的生長因子基因轉(zhuǎn)入MSCs，促使其定向分化。

MSC的純化方法有貼壁篩選法，流式細胞儀分選法，密度梯度離心法，免疫磁珠法。如果能找到更特異性標記物，就可以獲得更純的MSCs，這對后續(xù)的實驗步驟所得的實驗數(shù)據(jù)有重要影響。

MSC為中胚層來源的干細胞，難于使其直接定向分化為外胚層來源的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞[8]，而且MSC直接移植后只有少量細胞能分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞，因此要通過MSC獲得神經(jīng)干細胞，再分化為神經(jīng)前體細胞，進一步分化為成熟的神經(jīng)細胞。Nestin抗體（巢蛋白）為神經(jīng)干細胞的特異性抗體，而MAP-2抗體為成熟神經(jīng)元特異性標志。

MSC表達許多生長因子和細胞因子受體以及細胞與細胞黏附作用的受體，提示MSC的功能受自分泌和旁分泌循環(huán)的調(diào)控。這成為不同方法誘導(dǎo)MSCs定向分化的理論基礎(chǔ)。目前，體外誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)樣細胞分化有4種方法：生長因子誘導(dǎo)，抗氧化劑誘導(dǎo)，中藥誘導(dǎo)，增加MSCs內(nèi)cAMP誘導(dǎo)。

1 生長因子誘導(dǎo)方法

Sanchez-Ramos等[9]將BMSC（Bone marrow stromal cells）用10ng/mLEGF預(yù)誘導(dǎo)，再用腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）誘導(dǎo)，見其表達巢蛋白（nestin）。同時也表達GFAP和 NeuN.當(dāng)將人或鼠的BMSCs與小鼠的中腦細胞或紋狀體細胞共培養(yǎng)，結(jié)果有很小比例（0.2%~5%）MSCs表達神經(jīng)膠質(zhì)細胞標記物-神經(jīng)膠質(zhì)元纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）和神經(jīng)元標記物-神經(jīng)元特異核蛋白(Neuron-specific nuclear protein,NeuN)。這種方法常用于誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細胞的研究。

張卉以含有堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）或表皮生長因子 (EGF)加bFGF，或bFGF、EGF加全反式維甲酸(ATRA)的培養(yǎng)液培養(yǎng)BMSCs, 經(jīng)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)72 h后 , 纖維連接蛋白（fibronectin）和 I型膠原（collagen I）免疫陽性細胞減少。轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞（NSC）的nestin免疫陽性細胞增多。7d后其又減少。細胞分化后, 分化為神經(jīng)元（神經(jīng)元特異烯醇化酶-NSE）的陽性細胞最多占細胞總數(shù)的24.76%±2.72% ,同時分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞的GFAP陽性細胞占細胞總數(shù)的36.58%±3.26%[10]。bFGF參與骨髓MSC向神經(jīng)分化的啟動[11]，同時bFGF又可促使神經(jīng)前體細胞對EGF產(chǎn)生反應(yīng)，兩者聯(lián)用有明顯的協(xié)同作用，發(fā)揮增殖效應(yīng)[12]。從胚胎發(fā)育的過程來看，EGF及其受體出現(xiàn)要比bFGF晚，研究表明EGF多促進MSCs向膠質(zhì)前體細胞分化，而bFGF主要對神經(jīng)元前體細胞的分化有促進作用[13，14]。

有人在MSC培養(yǎng)基中加入神經(jīng)膠質(zhì)生長因子（glial growth factor,GGF）,觀察其可以向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化，并表達GFAP。

Anthony等應(yīng)用activinA（活化蛋白A），?；撬岷虴GF對成人CD90+MSCs體外誘導(dǎo)分化后，20%~32%的細胞表達感光細胞特異標志——視紫紅質(zhì)，視蛋白，recoverin(恢復(fù)蛋白)[8]。受此實驗啟發(fā)，可知在不同的化學(xué)誘導(dǎo)條件下，MSCs可能分化為不同類型的視網(wǎng)膜細胞。

孫旭芳等[15]用DMEM/F12(含10%FCS胎牛血清和100u/mL P/S) 1:1添加0.6%葡萄糖，1×ITS（胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒化物，insulin transferring selenium）,2mM谷酰胺，3mM碳酸氫鈉，20ng/mLEGF,20ng/mLbFGF,5mMHepes制成分化液Ⅰ誘導(dǎo)6~10代rMSC14天后，檢測其高表達神經(jīng)干細胞特異性標志物nestin。培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞, 收集視網(wǎng)膜細胞培養(yǎng)上清液加入10%的FCS,與視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞培養(yǎng)液按照1:1混合，制成分化液Ⅱ，使形成的神經(jīng)球形體在模擬眼內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)下分化出視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細胞，48h用免疫熒光檢測，部分細胞NeuN,Thy1.1染色陽性（Thy-1位于哺乳動物RGCs.Thy-1.1抗原僅表達在大鼠神經(jīng)節(jié)細胞上，用于鑒定大鼠RGCs），少數(shù)細胞表達GFAP。

牟大鵬等[16]先把分離到的視網(wǎng)膜組織加入DMEM培養(yǎng)液并用阿糖胞苷（Ara-C以抑制非神經(jīng)細胞的增殖后）處理后，將視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞培養(yǎng)液的上清液收集于干凈玻璃瓶中，真空抽濾后按2:3比例與DMEM培養(yǎng)液混合后誘導(dǎo)分化2~4代的rMSCs,2d后即可見神經(jīng)元樣細胞出現(xiàn)，7d神經(jīng)元樣細胞占細胞總數(shù)的26~27%，免疫熒光檢測β–tubulinⅢ（又稱微管蛋白是RGCs早期和成熟期的標志物）陽性為18%±3%，Neurofilament protein(NF，神經(jīng)絲蛋白，是神經(jīng)元的特異性標志物)陽性率為23%±4%，3天后免疫組化Nestin陽性數(shù)為30.9%±7.7%，MAP-2染色陽性。

在視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞上清液制成的微環(huán)境中，視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)如各種糖蛋白，粘蛋白，各種神經(jīng)營養(yǎng)因子，各種細胞因子等可以維持骨髓源性神經(jīng)干細胞生存，并向特定的視網(wǎng)膜細胞分化的良好環(huán)境。

bFGF誘導(dǎo)方法是誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元方向分化的經(jīng)典方法[17]，其優(yōu)點在于可以獲得較多的神經(jīng)元樣細胞。劉東寧等[18]先用含10ng/mL bFGF的DMEM/F12(10%FBS)預(yù)誘導(dǎo)24h,再加入DMEM/F12,10ng/mL bFGF,2%二甲基亞砜，200umol/L丁羥茴醚，10umol/L福斯高林，5mmol/L KCl,2mmol/L丙戊酸，5ug/mL胰島素的神經(jīng)誘導(dǎo)基誘導(dǎo)第3代BMSCs7天。免疫化學(xué)鑒定1~7d可見神經(jīng)元樣細胞MAP-2(抗微絲微管相關(guān)蛋白-2)74.2%，Thy1.1陽性，GFAP陰性。也說明bFGF誘導(dǎo)后細胞主要向成熟神經(jīng)元方向分化，而不是神經(jīng)膠質(zhì)細胞。bFGF誘導(dǎo)雖然可以獲得較多的成熟神經(jīng)元，但難以長期存活，聯(lián)合其他神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)生長因子進行維持培養(yǎng)，有利于誘導(dǎo)后神經(jīng)元的長期存活。

BMSCs與新生鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞共培養(yǎng)后可分化為RGCs(retinal ganglion cells,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞)特異性抗體Thy1.1表達陽性的細胞[19]。利用出生1~3d的乳鼠視網(wǎng)膜細胞作為誘導(dǎo)劑置于Transwell雙層培養(yǎng)板的上層使未成熟的視網(wǎng)膜組織內(nèi)促進原始視網(wǎng)膜干細胞分化和發(fā)育的細胞因子，受體(BDNF,NGF,TrkB受體等)及細胞外基質(zhì)成分，通過上層濾膜孔擴散至下層BMCs周圍，模擬了原始視網(wǎng)膜發(fā)育的微環(huán)境。本實驗說明BMSCs經(jīng)化學(xué)性誘導(dǎo)和視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)均可特異性分化為具有RGCs表型的細胞。

一些體外實驗還證實，還有許多因子調(diào)節(jié)MSC的分化方向，如胰島素樣生長因子Ⅰ(insulinlike growth factorⅠ,IGFⅠ)和腦源性生長因子(brain-derived growth factor,BDGF)被證實支持神經(jīng)元方向分化。而睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophlic factor,CNF）和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）作用于多潛能MSC,誘導(dǎo)它們分化成星形膠質(zhì)細胞.

2 抗氧化劑誘導(dǎo)

活性氧(ROS)是氧分子還原成水時產(chǎn)生的許多活性中間體的統(tǒng)稱,包括過氧化氫(H2O2/超氧陰離子(O2ˉ)/羥自由基(·OH)等。有學(xué)者證實[20]抗氧化劑可上調(diào)細胞P53基因轉(zhuǎn)錄表達的同時可下調(diào)c-myc基因的表達，從而調(diào)控細胞周期誘導(dǎo)干細胞分化。

Woodbury 等[21]報道,將鼠和成年人的MSCs先用2-巰基乙醇（ME-2）的DMEM/FBS誘導(dǎo)，以啟動MSCs的神經(jīng)細胞分化，接近80%出現(xiàn)神經(jīng)細胞的表型和表達神經(jīng)細胞標志性蛋白NSE（神經(jīng)元特異性烯醇化酶）,NF-M（神經(jīng)絲蛋白）,NeuN（神經(jīng)元特異性核內(nèi)抗原）。進一步用二甲亞砜，丁羥基苯甲醚，叔丁基對甲氧酚的DMEM中誘導(dǎo)，一周內(nèi)超過50%的MSCs出現(xiàn)神經(jīng)細胞形態(tài)學(xué)的改變，且以神經(jīng)元標記物NSE，M-神經(jīng)絲或Tau增高為主。

項鵬等[22]分別采用含巰基乙醇和硫代甘油等試劑的無血清DMEM誘導(dǎo)MSC分化為神經(jīng)元，結(jié)果示誘導(dǎo)24小時,MSCs中約75.5%的NSE 陽性而GFAP陰性。賈延劼等[23]在β-巰基乙醇預(yù)誘導(dǎo)MSCs 24h ,再誘導(dǎo)5h, NSE表達率為 (63.7±4.5 ) %。

3 中藥誘導(dǎo)

肖慶忠等[24]采用含100 ~ 150mg/L麝香多肽的無血清L -DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)成年大鼠和人BMMSCs分化為神經(jīng)元，免疫組化顯示神經(jīng)元樣細胞NSE（93.5%）,NF（88.2%）,nestin表達陽性，GFAP陰性。

項鵬等[25]分別采用含丹參注射液或硫代甘油等試劑的無血清達樂伯克改良必需基本培養(yǎng)基 (DMEM)誘導(dǎo)MSC分化為神經(jīng)元。與傳統(tǒng)的誘導(dǎo)分化劑硫代甘油相似，但細胞存活時間較久。

撒亞蓮[26]用三七總皂甙和賈延劼等用黃荃甙誘導(dǎo)MSCs,均得到同樣的結(jié)果。此外,黃芪、天麻、人參、當(dāng)歸、腦新舒、人參蜂王漿多種傳統(tǒng)中藥成分及中藥制劑體外均能誘導(dǎo)大鼠分化為神經(jīng)元樣細胞[27]。

4 增加MSCs內(nèi)cAMP誘導(dǎo)其分化

可從基因水平上，誘導(dǎo)MSCs沿著特定的路徑增殖發(fā)育成各種神經(jīng)細胞。

Deng weiwen等[28]發(fā)現(xiàn)未分化的hMSCs可表達一些神經(jīng)細胞的標志物，如微管蛋白(TuJ-1，neuron-specific tubulin), 神經(jīng)元特異性烯醇酶（NSE），微管相關(guān)蛋白(MAP1B，microtubule-associated protein 1B)及波形蛋白(vimentin)。在培養(yǎng)基內(nèi)加入誘導(dǎo)劑0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IMBX，isobutylmethylxanthine)和1mM cAMP類似物雙丁酰環(huán)磷腺苷(dbcAMP，dibutyryl cyclic AMP)，誘導(dǎo)6天,約有25%的MSCs 分化為典型的神經(jīng)細胞形態(tài), NSE 和 vimentin表達增高,且這種分化是不可逆的。提示：在體外，通過增加細胞內(nèi)cAMP水平，可使MSCs分化為早期的神經(jīng)前體細胞。

項鵬、夏文杰等[29]采用含腺苷酸環(huán)化酶激動劑Forskolin及磷脂酶抑制劑3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)的無血清DMEM誘導(dǎo)MSC分化為神經(jīng)元。

5 幾種誘導(dǎo)因素的比較

對以上幾種誘導(dǎo)因素綜合比較可用增加胞內(nèi)cAMP使MSCs分化為神經(jīng)前體細胞，用抗氧化劑誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細胞，用生長因子誘導(dǎo)途徑分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元細胞。此外應(yīng)用中藥誘導(dǎo)也不失為一種可行方法。雖然后三種方法還未應(yīng)用于誘導(dǎo)MSCs分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細胞，但卻展示了其良好的發(fā)展前景。

6 問題與展望

不僅是不同誘導(dǎo)途徑的差別，在MSCs培養(yǎng)，MSCs表面標志的檢測，視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的培養(yǎng)，MSCs向視網(wǎng)膜神經(jīng)樣細胞的分化，每一個環(huán)節(jié)都會影響免疫組化和RT-PCR監(jiān)測到的陽性率。影響MSCs向神經(jīng)細胞分化的因素比較復(fù)雜：有內(nèi)源性因素，如細胞質(zhì)對核的影響；外源性因素，如相鄰細胞的相互作用；細胞外環(huán)境因素：如細胞因子，激素等。而且這些因素如何起作用的機制不清，還需從形態(tài)特征，超微結(jié)構(gòu)，分子生物學(xué)，生理學(xué)等角度進一步研究。不能急功近利的在短期內(nèi)制備出完美的微環(huán)境，只能以體外一次次分析每個誘導(dǎo)因素的作用，逐漸完善模擬的微環(huán)境。誘導(dǎo)后的細胞是否具有視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的一系列功能還不是完全清楚。并且對這些因子的研究大多是在體外排除其他因素影響的情況下進行研究的，而在體內(nèi)則是通過相互作用起效應(yīng)的，如何發(fā)揮多種因子協(xié)同作用，仍待解決。

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福建省重點科研課題（基金編號：2008Y0040）。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。